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s100700677新蟲 (初入文壇)
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[交流]
PET-32a雙酶切無(wú)法回收 已有8人參與
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用SalI和NotI雙酶切和t載體連接的目的片段及pET-32a空載體，發(fā)現(xiàn)目的片段能一次性順利回收回來(lái)并且鑒定完全正確，但空載體酶切后不是沒(méi)有條帶（提的質(zhì)粒已經(jīng)鑒定，濃度和質(zhì)量絕對(duì)么有問(wèn)題），要不有帶但經(jīng)回收后鑒定時(shí)就消失了�。。�！做了有四次了，只有一次有條帶但鑒定沒(méi)有了!剩下的都是回收時(shí)沒(méi)有條帶�。。。� 個(gè)人分析： 1,酶沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)槟康臈l帶順利回收！ 2,膠，緩沖液及試劑盒沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)槟康臈l帶順利回收！ 3,沒(méi)有降解問(wèn)題，因?yàn)橛袥](méi)有酶切的載體做對(duì)照！且marker跑的很好！ 4,提的質(zhì)粒沒(méi)有問(wèn)題吧？！鑒定過(guò)了，三條帶非常完整，且亮度足夠！ 5,酶切是在37度下進(jìn)行，試過(guò)過(guò)夜，5小時(shí)，4小時(shí)，3小時(shí)！體系也試過(guò)40ul20ul的等等都優(yōu)化了，結(jié)果都一樣！ 這個(gè)實(shí)驗(yàn)以前做過(guò)，同樣的實(shí)驗(yàn)，只不過(guò)最近在重復(fù)做，但就遇到這種情況了，遇到鬼了！ 希望各位能幫忙分析一下！不甚感激�。。。�！謝謝�。。。�！ |
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syn1985
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2樓2012-06-30 15:20:15
yuzhiming
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3樓2012-07-01 11:32:03
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兩種情況： 一、可能在酶切過(guò)程中存在污染，第一你用的滅菌水有沒(méi)有問(wèn)題？第二在37度酶切時(shí)你用封口膜把EP管的口封實(shí)了么？因?yàn)樵谶@個(gè)溫度下酶切水浴鍋里的水可能會(huì)進(jìn)去，會(huì)把質(zhì)粒降解掉。 二、在酶切后跑電泳有其他雜帶么？如果有的 話可能你加的酶的量太多了，這兩個(gè)酶的特異性如果不太好的 話，在酶量過(guò)多的情況下就會(huì)把質(zhì)粒切成小片段，而目的基因不會(huì)的原因是質(zhì)粒是圓形的，比目的基因更好切， |
4樓2012-07-01 12:22:17
boyx
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5樓2012-07-01 12:42:11
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我今天也要做跟樓主一模一樣的實(shí)驗(yàn). 空載體酶切后不是沒(méi)有條帶——這個(gè)很詭異，怎么說(shuō)就算沒(méi)切完全或者根本沒(méi)有切上也該有條帶的，可能的原因就是樓主酶切的時(shí)候質(zhì)粒降解了或者被污染了. 要不有帶但經(jīng)回收后鑒定時(shí)就消失了——問(wèn)一下樓主酶切后驗(yàn)證時(shí)候電泳條帶清晰否，如果不清晰說(shuō)明濃度太低，膠回收本來(lái)就有損失，不同試劑盒損失量不同，如果清晰的話，那就說(shuō)明膠回收操作或者試劑盒有問(wèn)題. 樓主逐一排除吧，祝樓主好運(yùn).  |
6樓2012-07-02 15:13:09
天使托
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1：確定你的質(zhì)粒pet是否正確？ 2：酶切體系的問(wèn)題，你說(shuō) “空載體酶切后不是沒(méi)有條帶（提的質(zhì)粒已經(jīng)鑒定，濃度和質(zhì)量絕對(duì)么有問(wèn)題），要不有帶但經(jīng)回收后鑒定時(shí)就消失了！�。�！ 如果酶切體系不合適，質(zhì)粒太少，體系太大，點(diǎn)樣量過(guò)少，根本不會(huì)有條帶！ 還有一種，有條帶，回收后就沒(méi)有條帶了，那肯定是純化/回收過(guò)程有問(wèn)題，將質(zhì)粒損失掉了！ 個(gè)人建議，供參考！ 祝好運(yùn)！ |
7樓2012-07-02 19:24:46
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樓主問(wèn)題解決了嗎？我也遇到了同樣的問(wèn)題，酶切后跑膠條帶則挺亮的。但是一回收測(cè)濃度就特別低，純度也不好，同時(shí)膠回收別的就可以，只有pET32a不行 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2020-10-02 11:30:31
junjieshao
禁蟲 (小有名氣)
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
9樓2020-10-03 00:43:47
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