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lixilei1314金蟲 (小有名氣)
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[求助]
雙酶切后目的條帶的疑問？
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如何： 小弟最近在做重組質(zhì)粒的雙酶切，然后連接。 1，連接以后轉(zhuǎn)化BL21培養(yǎng)基篩選，老是不長細(xì)菌，基本上平板上一個細(xì)菌都不長，不知道是什么原因？沒連接好？ 2，看我雙酶切的條帶，PET-28雙酶切之后條帶很暗很暗（3ul的上樣量），同樣，第一個和第二個的目的條帶也很暗，第三個目的條帶比較亮。請問各位大俠這樣的條帶可以割膠回收做連接嗎？ 3， 為什么雙酶切之后，克隆載體亮度會比目的條帶的亮度亮很多呢？按說他們的濃度應(yīng)該是一樣的啊？ |
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xiaoweiwei121
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2樓2012-08-22 06:05:43
yyk81
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3樓2012-08-22 07:43:00
4樓2012-08-22 08:09:45
tanglian8655
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5樓2012-08-22 11:06:49
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lixilei1314: 金幣+2, 操作應(yīng)該是對了，昨晚剛換了新了抗生素，還是沒長東西。對了，我用的酶是TAKARA的NcoI 和Xho I 雙酶切，說明書上說的XhoI切除的末端連接效率很低，需要用平滑末端的連接條件，請問平滑末端的連接條件是什么樣子的？我就是延長連接時間，16度連接16小時。 2012-08-22 13:34:00
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lixilei1314: 金幣+2, 操作應(yīng)該是對了，昨晚剛換了新了抗生素，還是沒長東西。對了，我用的酶是TAKARA的NcoI 和Xho I 雙酶切，說明書上說的XhoI切除的末端連接效率很低，需要用平滑末端的連接條件，請問平滑末端的連接條件是什么樣子的？我就是延長連接時間，16度連接16小時。 2012-08-22 13:34:00
| 我也有過這種情況，雙酶切切出來的目的條帶比你這這個還淺，但測序是對的。你說涂板后細(xì)菌幾乎不長，是不是你在涂板的時候，酒精燈燒過的玻璃棒不等冷卻就直接用了？或者青霉素抗性弄錯了？ |
6樓2012-08-22 11:50:44
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銅蟲 (初入文壇)
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8樓2013-03-08 15:19:35
hao327791557
銀蟲 (小有名氣)
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9樓2013-07-21 11:48:06
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