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lixilei1314金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
雙酶切后目的條帶的疑問(wèn)？
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如何： 小弟最近在做重組質(zhì)粒的雙酶切，然后連接。 1，連接以后轉(zhuǎn)化BL21培養(yǎng)基篩選，老是不長(zhǎng)細(xì)菌，基本上平板上一個(gè)細(xì)菌都不長(zhǎng)，不知道是什么原因？沒(méi)連接好？ 2，看我雙酶切的條帶，PET-28雙酶切之后條帶很暗很暗（3ul的上樣量），同樣，第一個(gè)和第二個(gè)的目的條帶也很暗，第三個(gè)目的條帶比較亮。請(qǐng)問(wèn)各位大俠這樣的條帶可以割膠回收做連接嗎？ 3， 為什么雙酶切之后，克隆載體亮度會(huì)比目的條帶的亮度亮很多呢？按說(shuō)他們的濃度應(yīng)該是一樣的��？ |
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xiaoweiwei121
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lixilei1314: 金幣+2, ★★★很有幫助, 謝謝，晚上就做個(gè)空載體對(duì)照看看。 2012-08-22 13:27:15
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lixilei1314: 金幣+2, ★★★很有幫助, 謝謝，晚上就做個(gè)空載體對(duì)照看看。 2012-08-22 13:27:15
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1：做個(gè)對(duì)照試驗(yàn)沒(méi)，轉(zhuǎn)一下空載體，看看長(zhǎng)不長(zhǎng)，然后確定是不是連接的問(wèn)題 2：載體和第一、第二個(gè)目的條帶，量太少了，再加上回收過(guò)程中的損失，估計(jì)會(huì)看不到了，如果你想用于做連接，那就多切點(diǎn)吧。第三個(gè)目的條帶，看在濃度還可以 3：濃度相同，但是片段大小卻不相同 |
2樓2012-08-22 06:05:43
yyk81
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3樓2012-08-22 07:43:00
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助，熱心的蟲(chóng)蟲(chóng) 2012-08-22 15:13:28
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助，熱心的蟲(chóng)蟲(chóng) 2012-08-22 15:13:28
| 你這是大切的驗(yàn)證么？可以把剩下的全跑個(gè)回收膠瞅瞅，回收的時(shí)候弄的終體積小點(diǎn)，然后就能濃度大點(diǎn)，跑個(gè)電泳看看回收后濃度，如果還有這么淺，那就能連上。如果消失了，就多切點(diǎn)重切吧，呼呼。而且很明顯你個(gè)第一個(gè)第二個(gè)切的少了，載體才那個(gè)亮度，你指望比它短那么多的片段能多多少。 |
4樓2012-08-22 08:09:45
tanglian8655
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5樓2012-08-22 11:06:49
【答案】應(yīng)助回帖
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lixilei1314: 金幣+2, 操作應(yīng)該是對(duì)了，昨晚剛換了新了抗生素，還是沒(méi)長(zhǎng)東西。對(duì)了，我用的酶是TAKARA的NcoI 和Xho I 雙酶切，說(shuō)明書(shū)上說(shuō)的XhoI切除的末端連接效率很低，需要用平滑末端的連接條件，請(qǐng)問(wèn)平滑末端的連接條件是什么樣子的？我就是延長(zhǎng)連接時(shí)間，16度連接16小時(shí)。 2012-08-22 13:34:00
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lixilei1314: 金幣+2, 操作應(yīng)該是對(duì)了，昨晚剛換了新了抗生素，還是沒(méi)長(zhǎng)東西。對(duì)了，我用的酶是TAKARA的NcoI 和Xho I 雙酶切，說(shuō)明書(shū)上說(shuō)的XhoI切除的末端連接效率很低，需要用平滑末端的連接條件，請(qǐng)問(wèn)平滑末端的連接條件是什么樣子的？我就是延長(zhǎng)連接時(shí)間，16度連接16小時(shí)。 2012-08-22 13:34:00
| 我也有過(guò)這種情況，雙酶切切出來(lái)的目的條帶比你這這個(gè)還淺，但測(cè)序是對(duì)的。你說(shuō)涂板后細(xì)菌幾乎不長(zhǎng)，是不是你在涂板的時(shí)候，酒精燈燒過(guò)的玻璃棒不等冷卻就直接用了？或者青霉素抗性弄錯(cuò)了？ |
6樓2012-08-22 11:50:44
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7樓2013-03-04 21:33:13
8樓2013-03-08 15:19:35
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