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jghu9200木蟲 (小有名氣)
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[求助]
Reviewer提的兩個(gè)問題，求如何回答，如何做？萬分感謝
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Reviewer提的兩個(gè)問題，本人對這個(gè)問題有點(diǎn)拿不準(zhǔn)，求熱心戰(zhàn)友幫忙，如何回答？，如何做？萬分感謝 Reviewer #2: The authors did address most concerns of the reviewer. However, there is one technical issue which has to be clarified. 1. In the MM section, the authors state that "To ensure that the samples were free of genomic DNA, RNA samples were subjected to a reverse transcription in the absence of the reverse transcriptase. Our results didn't find any genomic DNA contamination." The authors are correct to assume that if there is any contamination with genomic DNA, then there should be amplification in the subsequent PCR. HOWEVER, in case the primer is an exon-intron spanning oligonucleotide and the amplified intron is too long, than this genomic contamination band will not be visible in a 1% agarose gel. I strongly suggest performing another control experiment with contaminated RNA to ensure that the assay performed is sufficient to detect genomic DNA contamination. 3. Which strategy was followed to evaluate real-time PCR experiments? |
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niil
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2013-09-27 15:35:40
jghu9200: 金幣+6, ★★★很有幫助 2013-09-28 21:29:16
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1. 審稿者認(rèn)為你的實(shí)驗(yàn)的對照有問題。你的對照是不加反轉(zhuǎn)錄酶，如果有條帶的話，就是DNA污染，但是，由于DNA含有內(nèi)含子，如果內(nèi)含子長度過長而且你的引物是跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)的，那么你依舊不能擴(kuò)出條帶了，但是這種情況下依舊會有DNA污染，所以審稿人讓你再設(shè)計(jì)其他的對照實(shí)驗(yàn)，以避免這樣的問題。或者，如果你有證據(jù)證明你的引物不是跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)的，那么只向?qū)徃迦苏f明這個(gè)問題，并在方法里也相應(yīng)加上說明就行了。 3.是問評估real-time PCR的方法。也就是你用什么方法來在證明你用這這個(gè)real-time PCR體系是有效的。一般來說，都是通過預(yù)實(shí)驗(yàn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來評估real-time PCR體系的優(yōu)劣的。 每對引物在正式試驗(yàn)之前都需要做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，看獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率是否符合標(biāo)準(zhǔn)。 |
3樓2013-09-27 14:00:30
fuyuandj86
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+2, 正解！Reviewer的推理也是合理的，你至少說明你的引物是如何設(shè)計(jì)的，擴(kuò)出基因組的條帶會是多少大小，直接拿基因組DNA用你的引物擴(kuò)增就可以了，做出一個(gè)有條帶的結(jié)果 2013-09-27 15:34:59
jghu9200: 金幣+4, ★★★很有幫助 2013-09-28 21:29:30
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gyesang: 金幣+2, 正解！Reviewer的推理也是合理的，你至少說明你的引物是如何設(shè)計(jì)的，擴(kuò)出基因組的條帶會是多少大小，直接拿基因組DNA用你的引物擴(kuò)增就可以了，做出一個(gè)有條帶的結(jié)果 2013-09-27 15:34:59
jghu9200: 金幣+4, ★★★很有幫助 2013-09-28 21:29:30
第一個(gè)說得很明白吧?讓你補(bǔ)試驗(yàn)?zāi)憔屠蠈?shí)補(bǔ)吧.雖然似乎有點(diǎn)挑剔 我理解就是讓你加個(gè)陽性對照,把RNA里面故意加入一點(diǎn)genomic DNA.然后用你的引物應(yīng)該可以在膠上看到污染. |
2樓2013-09-27 11:21:50
jghu9200
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4樓2013-09-28 21:27:50
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5樓2013-09-28 21:28:38
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