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lx0103新蟲 (小有名氣)
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[求助]
9.0kb載體與2.4kb片段為什么用T4連接酶連接，沒有得到陽性克隆？
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片段處理方法如下：2.4kb的PCR片段經(jīng)過跑膠切膠回收，濃度為100ng/ul，然后雙酶切，酶切體系如下:4ul 切膠回收的PCR片段 24ul（2.4ug）, BamH1-HF(NEB公司）1.5ul, Not1-HF（NEB公司）1.5ul, 10*Buffer 3ul，共30ul酶切體系，37度酶切過夜。PCR產(chǎn)物雙酶切后使用全式金公司凝膠回收試劑盒過柱子純化，即將30ul反應(yīng)體系直接加入到3倍體積的溶膠溶液，混勻后直接上柱子純化，跑膠檢測(cè)純化后的片段濃度為40ng/ul。 載體處理方法如下：9.0kb的載體雙酶切，雙酶切體系如下：5ug載體，BamH1-HF(NEB公司）1.5ul, Not1-HF（NEB公司）1.5ul, 10*Buffer 3ul，用無菌水補(bǔ)足至30ul，也是37度酶切過夜。然后切膠回收大的載體片段，跑膠檢測(cè)純化后的載體濃度為20ng/ul。 連接&轉(zhuǎn)化：用NEB公司的T4連接酶進(jìn)行連接，連接體系如下：片段6.5ul，載體8.5ul，10*buffer 3ul，T4 ligase 2ul，無菌水10ul，總體積30ul，摩爾比為10：1，室溫連接1.5h，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。做了一個(gè)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對(duì)照，保證轉(zhuǎn)化過程沒有出現(xiàn)問題。轉(zhuǎn)化平板在37度生長(zhǎng)16h。 結(jié)果：轉(zhuǎn)化平板上只長(zhǎng)了8個(gè)菌落，全部挑取做菌落PCR，發(fā)現(xiàn)沒有陽性克隆。 請(qǐng)求大家?guī)臀艺艺以颉? |
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