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yitiandeng木蟲 (著名寫手)
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[求助]
求助具體的（具體的）無連接酶亞克隆法全步驟，從PCR到克隆
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無連接酶亞克隆法 ，請親們看好說明啊，別解釋原理什么的[ Last edited by yitiandeng on 2012-4-8 at 15:52 ] |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yitiandeng: 金幣+30, 18 2012-04-08 20:19:37
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- 附件 2 : 重點 Successive hybridization assembly.rar
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| 通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產(chǎn)物的效率通過較高，。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19的HincⅡ位點進行克隆，以X－gal和IPTG篩選，�？傻玫阶懔恐亟M子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產(chǎn)物。 |
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