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yitiandeng木蟲(chóng) (著名寫手)
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[求助]
求助具體的（具體的）無(wú)連接酶亞克隆法全步驟，從PCR到克隆
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無(wú)連接酶亞克隆法 ，請(qǐng)親們看好說(shuō)明啊，別解釋原理什么的[ Last edited by yitiandeng on 2012-4-8 at 15:52 ] |
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1527017653
金蟲(chóng) (正式寫手)
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| 通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效率效低。因?yàn)門aqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個(gè)多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為3'突出一個(gè)堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產(chǎn)物的效率通過(guò)較高，。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時(shí)，可顯著提高其連接效率。對(duì)于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19的HincⅡ位點(diǎn)進(jìn)行克隆，以X－gal和IPTG篩選，�？傻玫阶懔恐亟M子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產(chǎn)物。 |
8樓2012-04-08 21:01:32
atlanticwi
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2樓2012-04-08 15:56:30
lvbobo823
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking: 金幣+2, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流！歡迎發(fā)表更多的見(jiàn)解！ 2012-04-08 17:13:26
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你是不是說(shuō)的是Invitrogen公司的Gateway技術(shù)？ 1.高保真酶利用前引物含有CACC的引物組合克隆目的片段，純化回收 2.Invitrogen公司pENTR載體試劑盒 pENTR 1UL Salt solution 1ul PCR 產(chǎn)物 3ul 25度反應(yīng)半小時(shí)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 |
3樓2012-04-08 17:10:22
atlanticwi
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樓主問(wèn)的是亞克隆技術(shù)哦，不是我挑刺，嚴(yán)格的說(shuō)，入門克隆并不算亞克隆技術(shù)，而是克隆技術(shù)，之后的LR反應(yīng)轉(zhuǎn)入不同的載體才算是亞克隆技術(shù)，況且如果你以下的反應(yīng)體系是搬自說(shuō)明書的話，也是錯(cuò)的，說(shuō)明書推薦6uL體系，你總共加起來(lái)只有5uL，反應(yīng)半個(gè)小時(shí)，是會(huì)極大降低重組效率的，說(shuō)明書一般推薦5min左右，隨片段長(zhǎng)度而改變，我們就是用3Kb的去連接也只用15min左右，所以朋友，要嚴(yán)謹(jǐn)  |
4樓2012-04-08 18:16:12
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