【答案】應(yīng)助回帖

11樓2013-10-16 11:03:17

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學(xué)海打浪

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11樓: Originally posted by 學(xué)海打浪 at 2013-10-16 11:03:17
一般情況下溶解曲線都是在80度以上，你那個(gè)很有可能是引物二聚體

可以在做之前先用引物做一下普通pcr，然后跑下電泳看看有沒有帶

12樓2013-10-16 11:04:59

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taccycle

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

1、把cDNA稀釋10倍的話其Ct值才增大3.2左右，只要你的Ct最后能落在33以內(nèi)機(jī)器檢測(cè)的準(zhǔn)確度就沒有什么影響，所以只要你目的基因的Ct值在30以內(nèi)，你就可以大膽放心的稀釋，你可以先稀釋5倍測(cè)試一下。
2、檢測(cè)有沒有引物二聚體你可以配一個(gè)3%的瓊脂糖膠把PCR產(chǎn)物跑一個(gè)電泳，選擇一個(gè)合適的Marker，比如DL500，引物二聚體一般都小于100bp，如果只有一條size正確的條帶，那就說明沒有引物二聚體
3、Tm值不能說明這個(gè)峰是不是引物二聚體，我的目的條帶的Tm有的只有75℃
4、模板用量不會(huì)影響定量結(jié)果（只要不是那種極端用量），這是理論上決定的，就算有影響也是微乎其微的

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13樓2013-10-16 16:24:57

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8樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-15 22:12:45
循環(huán)數(shù)目還可以。把熔解曲線發(fā)上來看看你說的Tm問題吧，一般正常產(chǎn)物的熔解溫度在80°C以上的。...

85°的是內(nèi)參，77.9的是目的基因VCAM,這樣的有問題沒？

實(shí)時(shí)熒光定量pcr，cDNA的加入量會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確度嗎？

101111.png

14樓2013-10-16 20:51:12

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12樓: Originally posted by 學(xué)海打浪 at 2013-10-16 11:04:59
可以在做之前先用引物做一下普通pcr，然后跑下電泳看看有沒有帶...

我也想跑電泳，瓊脂糖電泳我就沒跑出來過，不管是ran還是dna的，快急死了，后來想熒光定量pcr應(yīng)該更準(zhǔn)確才對(duì)，就沒怎么再跑過電泳。如果是引物二聚體，也應(yīng)該有目的基因的峰啊？可是我的沒有啊，只有一個(gè)峰！

15樓2013-10-16 20:54:33

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13樓: Originally posted by taccycle at 2013-10-16 16:24:57
1、把cDNA稀釋10倍的話其Ct值才增大3.2左右，只要你的Ct最后能落在33以內(nèi)機(jī)器檢測(cè)的準(zhǔn)確度就沒有什么影響，所以只要你目的基因的Ct值在30以內(nèi)，你就可以大膽放心的稀釋，你可以先稀釋5倍測(cè)試一下。
2、檢測(cè)有沒有引 ...

謝謝啊，我跑電泳使用1%的瓊脂糖，還從來沒有跑出來過，mark只有2000bp的，不敢再買別的了，我想知道是不是我的rna質(zhì)量太差了，OD260/OD230都小于1，這樣會(huì)不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果?我的電泳都沒有跑出來過條帶，不管是rna還是dna，但是pcr可以有結(jié)果，1%的膠，是不是也可以不用電泳來驗(yàn)證？

16樓2013-10-16 21:00:38

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cicelyzh

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14樓: Originally posted by 963979587 at 2013-10-16 20:51:12
85°的是內(nèi)參，77.9的是目的基因VCAM,這樣的有問題沒？

101111.png
...

感覺你的熔解峰還可以，雖然溫度比較低。如果擴(kuò)增曲線也是標(biāo)準(zhǔn)的S型，應(yīng)該是產(chǎn)物了。

17樓2013-10-17 00:09:06

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taccycle

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16樓: Originally posted by 963979587 at 2013-10-16 21:00:38
謝謝啊，我跑電泳使用1%的瓊脂糖，還從來沒有跑出來過，mark只有2000bp的，不敢再買別的了，我想知道是不是我的rna質(zhì)量太差了，OD260/OD230都小于1，這樣會(huì)不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果?我的電泳都沒有跑出來過條帶，不管是rn ...

RNA電泳的話要用1%的膠和那個(gè)2000的Marker，如果沒有電泳條帶就說明你的RNA濃度有點(diǎn)低，那你反轉(zhuǎn)錄的時(shí)候可以多用點(diǎn)RNA，同時(shí)相應(yīng)減少體系中水的用量。1%的膠不適合用來檢測(cè)短片段，你至少配制個(gè)2%的膠，這樣用2000的Marker也可以的

用心

18樓2013-10-17 11:25:18

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3樓: Originally posted by asr at 2013-10-14 23:29:42
20ul體系中3ug的rna反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，取4ul作為pcr的模板

量明顯太高了，先摸摸條件呀

我表示贊同斑竹。我們都是做了cdna后，稀釋1倍作為模板的。也就是說假設(shè)逆轉(zhuǎn)錄是20μl體系，要稀釋成40μl之后取1微升為模板。您這個(gè)量實(shí)在是太多了

應(yīng)助之星就是我~沒錯(cuò)。你沒有看錯(cuò)~

19樓2013-10-18 16:50:54

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17樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-17 00:09:06
感覺你的熔解峰還可以，雖然溫度比較低。如果擴(kuò)增曲線也是標(biāo)準(zhǔn)的S型，應(yīng)該是產(chǎn)物了。...

謝謝啊，等有細(xì)胞了我再重新做一次，這次稀釋一下做做，