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963979587銀蟲 (初入文壇)
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實時熒光定量pcr，cDNA的加入量會影響結(jié)果的準確度嗎？
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| 大家好，最近一直做熒光定量pcr，20ul體系中3ug的rna反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，取4ul作為pcr的模板，10ul EvaGreen，4ul引物，2ulRNas水，這個體系可以得到挺好的結(jié)果，但是溶解曲線的溫度在77°，不知道是不是引物二聚體，而且我覺得模板的量加的太多了，實驗不能重復(fù)，一次就用光了，不知道是不是應(yīng)該稀釋一下？ |
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3樓2013-10-14 23:29:42
taccycle
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1、把cDNA稀釋10倍的話其Ct值才增大3.2左右，只要你的Ct最后能落在33以內(nèi)機器檢測的準確度就沒有什么影響，所以只要你目的基因的Ct值在30以內(nèi)，你就可以大膽放心的稀釋，你可以先稀釋5倍測試一下。 2、檢測有沒有引物二聚體你可以配一個3%的瓊脂糖膠把PCR產(chǎn)物跑一個電泳，選擇一個合適的Marker，比如DL500，引物二聚體一般都小于100bp，如果只有一條size正確的條帶，那就說明沒有引物二聚體 3、Tm值不能說明這個峰是不是引物二聚體，我的目的條帶的Tm有的只有75℃ 4、模板用量不會影響定量結(jié)果（只要不是那種極端用量），這是理論上決定的，就算有影響也是微乎其微的 |
13樓2013-10-16 16:24:57
cicelyzh
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