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963979587銀蟲(chóng) (初入文壇)
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實(shí)時(shí)熒光定量pcr，cDNA的加入量會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確度嗎？
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| 大家好，最近一直做熒光定量pcr，20ul體系中3ug的rna反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，取4ul作為pcr的模板，10ul EvaGreen，4ul引物，2ulRNas水，這個(gè)體系可以得到挺好的結(jié)果，但是溶解曲線的溫度在77°，不知道是不是引物二聚體，而且我覺(jué)得模板的量加的太多了，實(shí)驗(yàn)不能重復(fù)，一次就用光了，不知道是不是應(yīng)該稀釋一下？ |
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 QPCR實(shí)驗(yàn)困惑 |
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3樓2013-10-14 23:29:42
taccycle
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1、把cDNA稀釋10倍的話其Ct值才增大3.2左右，只要你的Ct最后能落在33以內(nèi)機(jī)器檢測(cè)的準(zhǔn)確度就沒(méi)有什么影響，所以只要你目的基因的Ct值在30以內(nèi)，你就可以大膽放心的稀釋，你可以先稀釋5倍測(cè)試一下。 2、檢測(cè)有沒(méi)有引物二聚體你可以配一個(gè)3%的瓊脂糖膠把PCR產(chǎn)物跑一個(gè)電泳，選擇一個(gè)合適的Marker，比如DL500，引物二聚體一般都小于100bp，如果只有一條size正確的條帶，那就說(shuō)明沒(méi)有引物二聚體 3、Tm值不能說(shuō)明這個(gè)峰是不是引物二聚體，我的目的條帶的Tm有的只有75℃ 4、模板用量不會(huì)影響定量結(jié)果（只要不是那種極端用量），這是理論上決定的，就算有影響也是微乎其微的 |
13樓2013-10-16 16:24:57
cicelyzh
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2樓2013-10-14 22:31:01
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12樓2013-10-16 11:04:59
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15樓2013-10-16 20:54:33
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18樓2013-10-17 11:25:18
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19樓2013-10-18 16:50:54
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5樓2013-10-15 10:22:46
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