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gene121木蟲 (著名寫手)
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[求助]
誰做過畢赤酵母pPICzalpha的構(gòu)建？請幫忙
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誰做過畢赤酵母pPICzalpha的構(gòu)建，請問 1.構(gòu)建的時候，有沒有什么地方要注意的，尤其是酶切位點的選擇，是不是不需要考慮起始位點，只要外源基因插進(jìn)去，插到多克隆位點處，方向?qū)α司托�，還是有要求？ 2.博來霉素，有沒有便宜的廠家推薦下， 謝謝，這玩意太TM貴了，用不起啊！ 3.pPICzalpha質(zhì)粒系列里面的 A B C D有什么區(qū)別？是不是位點不一樣？ 請做過的同志詳細(xì)解答下，如果可以，我會追加金幣至100！謝謝！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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gene121(kx444555代發(fā)): 金幣+6, 鼓勵交流 2013-10-26 22:04:04
gene121: 金幣+14 2014-04-17 14:23:37
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gene121: 金幣+14 2014-04-17 14:23:37
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我最近也在弄關(guān)于畢赤酵母表達(dá)的載體用的是PpiczαA。本人實驗還處與設(shè)計階段。你問的問題除了第二個，第一個問題和第三個問題說明書里都有的。我只能給你建議，你可以考證是否正確但是我的引物已經(jīng)去合成了，我認(rèn)為我的對，但是涉及到你自己的實驗，一定要多重考證我說的話。 1.你要構(gòu)建時首先要考慮酶切位點用哪個，如果你要用Ppiczα系列，我勸你XHO Ⅰ這個位點不要用，這個位點在這個載體之中有兩個，其中一個位于KEX2酶切位點之前，你要是用的話必須在上游引物把這個位點補(bǔ)齊，后期還要篩選正反向的問題。我沒用這個酶切位點太麻煩了，我用的是ECORⅠ，xbaⅠ。你選擇自己的酶切位點首先要考慮你選的酶切位點在你的目的基因里面一定不要有。然后就是這兩個酶切位點要有共用的BUFFER。然后方向搞清楚。再就是千萬別移碼。我的下游引物除了保護(hù)性堿基，酶切位點之外多加了兩個堿基，確保不移碼，這個千萬要記住啊（移碼這個問題，做表達(dá)的時候是必須考慮的）。 第二個問題：不知道 第三個問題：A,B,C之間的區(qū)別是PstⅠ這個位點只存在B載體中。Cla這個位點只存在于C載體中。 還有就是你看看關(guān)于這個載體的說明書吧 |
2樓2013-10-26 21:18:38
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