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gene121木蟲(chóng) (著名寫手)
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[求助]
誰(shuí)做過(guò)畢赤酵母pPICzalpha的構(gòu)建？請(qǐng)幫忙
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誰(shuí)做過(guò)畢赤酵母pPICzalpha的構(gòu)建，請(qǐng)問(wèn) 1.構(gòu)建的時(shí)候，有沒(méi)有什么地方要注意的，尤其是酶切位點(diǎn)的選擇，是不是不需要考慮起始位點(diǎn)，只要外源基因插進(jìn)去，插到多克隆位點(diǎn)處，方向?qū)α司托�，還是有要求？ 2.博來(lái)霉素，有沒(méi)有便宜的廠家推薦下， 謝謝，這玩意太TM貴了，用不起啊！ 3.pPICzalpha質(zhì)粒系列里面的 A B C D有什么區(qū)別？是不是位點(diǎn)不一樣？ 請(qǐng)做過(guò)的同志詳細(xì)解答下，如果可以，我會(huì)追加金幣至100！謝謝！ |
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haixunan
新蟲(chóng) (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
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gene121(kx444555代發(fā)): 金幣+6, 鼓勵(lì)交流 2013-10-26 22:04:04
gene121: 金幣+14 2014-04-17 14:23:37
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gene121: 金幣+14 2014-04-17 14:23:37
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我最近也在弄關(guān)于畢赤酵母表達(dá)的載體用的是PpiczαA。本人實(shí)驗(yàn)還處與設(shè)計(jì)階段。你問(wèn)的問(wèn)題除了第二個(gè)，第一個(gè)問(wèn)題和第三個(gè)問(wèn)題說(shuō)明書(shū)里都有的。我只能給你建議，你可以考證是否正確但是我的引物已經(jīng)去合成了，我認(rèn)為我的對(duì)，但是涉及到你自己的實(shí)驗(yàn)，一定要多重考證我說(shuō)的話。 1.你要構(gòu)建時(shí)首先要考慮酶切位點(diǎn)用哪個(gè)，如果你要用Ppiczα系列，我勸你XHO Ⅰ這個(gè)位點(diǎn)不要用，這個(gè)位點(diǎn)在這個(gè)載體之中有兩個(gè)，其中一個(gè)位于KEX2酶切位點(diǎn)之前，你要是用的話必須在上游引物把這個(gè)位點(diǎn)補(bǔ)齊，后期還要篩選正反向的問(wèn)題。我沒(méi)用這個(gè)酶切位點(diǎn)太麻煩了，我用的是ECORⅠ，xbaⅠ。你選擇自己的酶切位點(diǎn)首先要考慮你選的酶切位點(diǎn)在你的目的基因里面一定不要有。然后就是這兩個(gè)酶切位點(diǎn)要有共用的BUFFER。然后方向搞清楚。再就是千萬(wàn)別移碼。我的下游引物除了保護(hù)性堿基，酶切位點(diǎn)之外多加了兩個(gè)堿基，確保不移碼，這個(gè)千萬(wàn)要記住啊（移碼這個(gè)問(wèn)題，做表達(dá)的時(shí)候是必須考慮的）。 第二個(gè)問(wèn)題：不知道 第三個(gè)問(wèn)題：A,B,C之間的區(qū)別是PstⅠ這個(gè)位點(diǎn)只存在B載體中。Cla這個(gè)位點(diǎn)只存在于C載體中。 還有就是你看看關(guān)于這個(gè)載體的說(shuō)明書(shū)吧 |
2樓2013-10-26 21:18:38
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