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zhouyangjue銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
看看咱這個電泳圖，菜鳥根本不懂。。
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普通凝膠電泳圖，三個2000的mark，目的片段630左右，用的PCR引物GC-341f和907r，PCR條件為 94 ℃預(yù)變性 5min；接下來是 94 ℃變性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，最后 4 ℃保溫。 PCR體系為50ul。引物濃度為0.4umol/L。其他的酶、dNTP、和鎂離子都是買的混合好的。大家?guī)臀铱聪挛疫@個是怎么回事，我接下來想做DGGE。 問題1：這個電泳圖膠有沒有問題，出現(xiàn)這個樣子是什么原因啊。 問題2：目的條帶位置是對的，想知道后面那些東西是什么？ 問題3：接下來是要做DGGE的，這樣有沒有影響，是否需要重新進行PCR，重新進行的話應(yīng)該如何調(diào)整。 希望大家可以指導(dǎo)我一下，師兄沒有做的，獨自摸索，望得到指導(dǎo)。問題可能有點菜，希望大家不要介意，耐心解答。 Image9.jpg |
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至尊木蟲 (著名寫手)
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9樓2013-10-21 18:24:45
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【答案】應(yīng)助回帖
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不能說幫助，只能是說盡我所能幫你看看~ 問題一、就結(jié)果而言，這個電泳圖沒有問題，因為你要的結(jié)果出來了630，你的目的條帶很明顯，出現(xiàn)這個樣子的原因包括很多。結(jié)合問題二，原因可能是循環(huán)數(shù)過高，退火溫度可能有點低，模板和引物的配比可能有點高等，詳情可以搜索PCR擴增出現(xiàn)非特異性條帶（雜帶）的原因。 問題二、目的條帶位置對的，后面的陰影是非特異性目的條帶，也就是所謂的雜帶。后面那個白色的拖帶不是太影響。 問題三、就目的而言，可以做DGGE，但是可能效果不好，因為雜帶的影響。會導(dǎo)致結(jié)果誤差。建議優(yōu)化下PCR實驗條件，使得干菜那個圖只有清晰的特異性條帶，沒有雜帶和二聚體等其他的影響因素。這樣做DGGE效果會最好。而且很容易得出你需要的實驗結(jié)論。否則效果不好判別。 希望對你有幫助…… |
3樓2013-10-21 11:12:53
zhouyangjue
銀蟲 (小有名氣)
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4樓2013-10-21 11:13:13
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