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多克隆酶切位點(diǎn)可以任意插入基因嗎？不用考慮啟動(dòng)子的距離嗎？
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我金幣多，重重有獎(jiǎng)！�。� 如圖的質(zhì)粒，在MCS之前有個(gè)ptb啟動(dòng)子，用于其后基因的表達(dá)；我想問的是啟動(dòng)子后的MCS可以隨意選擇嗎？不需要考慮啟動(dòng)子的距離或者其他序列嗎？比如有的文獻(xiàn)選用BamHI和AvaI作為外源基因插入位點(diǎn)；有的選擇NdeI單酶切插入一個(gè)基因也能表達(dá)。從序列上看，NdeI位點(diǎn)插入的比BamHI/AvaI位點(diǎn)插入的距離啟動(dòng)子要多130bp呢？這樣不經(jīng)過任何修飾直接插入基因也能表達(dá)？ [ Last edited by 看天 on 2013-10-25 at 17:28 ] |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 核酸方面 |
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啟動(dòng)子和起始密碼子是兩回事，往往MCS中啟動(dòng)子到起始密碼子（第一個(gè)氨基酸）中間會(huì)有一段距離（如表達(dá)載體，一般用來放置一些表達(dá)調(diào)控元件），對(duì)最終表達(dá)的目的蛋白是沒影響的。 至于插入位置，需要考慮：排除目的基因中含有的的酶切位點(diǎn)與MCS中相同的酶； 融合蛋白（載體提供，包括一些標(biāo)簽蛋白）是否需要，對(duì)目的蛋白是否有影響； 最關(guān)鍵的一點(diǎn)，讀碼框要正確； 然后還有一些理論外要考慮的，如酶是否常見好用、價(jià)格、是否有甲基化等麻煩等等~~ 通過這些的，理論上都能用，看你喜好怎么用了~~ P.S.：?jiǎn)蚊盖形稽c(diǎn)插目的基因時(shí)有一個(gè)麻煩，需要驗(yàn)證目的基因的“反正”，因?yàn)槟康钠蝺蓚?cè)是一樣的粘性末端。 |
4樓2013-10-28 14:42:17
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| 沒有影響的，MCS的意思是你在里面任意位置插入基因片段都不會(huì)影響轉(zhuǎn)錄的。如果你要做啟動(dòng)表達(dá)，如果真核表達(dá)最好在ATG前加入GCCACC序列，kozak序列，幫助表達(dá)。 |
5樓2013-10-28 15:15:29
2樓2013-10-27 23:19:10
3樓2013-10-28 13:44:54
bleach060452
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7樓2013-11-01 22:47:01
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看天: 金幣+20, ★★★★★最佳答案, 翻譯不是只有從目的基因的ATG開始的嗎？過克隆位點(diǎn)就已經(jīng)開始翻譯了？ 2013-11-06 23:04:10
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當(dāng)然要考慮！但不是考慮啟動(dòng)子的位置，要考慮你用的酶切位點(diǎn)到你目的基因的ATG的距離是不是3的整倍數(shù)，如果不是，那就移碼了，豈不是全亂了。 你要看的不是簡(jiǎn)單的質(zhì)粒圖譜，而是要看質(zhì)粒文件中給的一段核算序列的標(biāo)注。多克隆位點(diǎn)也是能夠翻譯出一段多肽的，你還不知道嗎？不同的酶切位點(diǎn)到你目的基因的ATG的距離可不總是3的整數(shù)倍，有的錯(cuò)（開）1個(gè)，有的錯(cuò)2個(gè)，有的錯(cuò)3個(gè)，只有錯(cuò)3個(gè)的才行！ |
8樓2013-11-02 09:08:51
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9樓2013-11-04 10:08:44
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