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多克隆酶切位點可以任意插入基因嗎？不用考慮啟動子的距離嗎？
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我金幣多，重重有獎！�。� 如圖的質(zhì)粒，在MCS之前有個ptb啟動子，用于其后基因的表達；我想問的是啟動子后的MCS可以隨意選擇嗎？不需要考慮啟動子的距離或者其他序列嗎？比如有的文獻選用BamHI和AvaI作為外源基因插入位點；有的選擇NdeI單酶切插入一個基因也能表達。從序列上看，NdeI位點插入的比BamHI/AvaI位點插入的距離啟動子要多130bp呢？這樣不經(jīng)過任何修飾直接插入基因也能表達？ [ Last edited by 看天 on 2013-10-25 at 17:28 ] |
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2樓2013-10-27 23:19:10
3樓2013-10-28 13:44:54
bleach060452
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看天: 金幣+20, ★★★★★最佳答案, 我也經(jīng)常聽別人強調(diào)讀碼框要正確，請問還會有造成某個基因讀碼框混亂的情況嗎？ 2013-10-28 17:30:03
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啟動子和起始密碼子是兩回事，往往MCS中啟動子到起始密碼子（第一個氨基酸）中間會有一段距離（如表達載體，一般用來放置一些表達調(diào)控元件），對最終表達的目的蛋白是沒影響的。 至于插入位置，需要考慮：排除目的基因中含有的的酶切位點與MCS中相同的酶； 融合蛋白（載體提供，包括一些標簽蛋白）是否需要，對目的蛋白是否有影響； 最關(guān)鍵的一點，讀碼框要正確； 然后還有一些理論外要考慮的，如酶是否常見好用、價格、是否有甲基化等麻煩等等~~ 通過這些的，理論上都能用，看你喜好怎么用了~~ P.S.：單酶切位點插目的基因時有一個麻煩，需要驗證目的基因的“反正”，因為目的片段兩側(cè)是一樣的粘性末端。 |
4樓2013-10-28 14:42:17
zhouxiaofei
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| 沒有影響的，MCS的意思是你在里面任意位置插入基因片段都不會影響轉(zhuǎn)錄的。如果你要做啟動表達，如果真核表達最好在ATG前加入GCCACC序列，kozak序列，幫助表達。 |
5樓2013-10-28 15:15:29
bleach060452
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7樓2013-11-01 22:47:01
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看天: 金幣+20, ★★★★★最佳答案, 翻譯不是只有從目的基因的ATG開始的嗎？過克隆位點就已經(jīng)開始翻譯了？ 2013-11-06 23:04:10
看天: 金幣+20, ★★★★★最佳答案, 翻譯不是只有從目的基因的ATG開始的嗎？過克隆位點就已經(jīng)開始翻譯了？ 2013-11-06 23:04:10
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當然要考慮！但不是考慮啟動子的位置，要考慮你用的酶切位點到你目的基因的ATG的距離是不是3的整倍數(shù)，如果不是，那就移碼了，豈不是全亂了。 你要看的不是簡單的質(zhì)粒圖譜，而是要看質(zhì)粒文件中給的一段核算序列的標注。多克隆位點也是能夠翻譯出一段多肽的，你還不知道嗎？不同的酶切位點到你目的基因的ATG的距離可不總是3的整數(shù)倍，有的錯（開）1個，有的錯2個，有的錯3個，只有錯3個的才行！ |
8樓2013-11-02 09:08:51
bleach060452
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9樓2013-11-04 10:08:44
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