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jbj1001銀蟲 (小有名氣)
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詭異的qPCR結(jié)果，請(qǐng)大家?guī)兔忉屜?
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樣品是小鼠的二細(xì)胞胚胎，做GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線，出現(xiàn)的結(jié)果讓我很困惑。用的是ABI的Arcturus® PicoPure™ RNA Isolation Kit，號(hào)稱能夠提取單個(gè)細(xì)胞的RNA，但由于由于收集的胚胎不多，所以提取的RNA的量還是比較少的，大約有40多ng在10ul反轉(zhuǎn)錄體系里面。今天做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)取了其中的3.5ul先稀釋10倍到35ul，然后依次按照5倍的梯度稀釋。實(shí)時(shí)定量PCR用的試劑盒是TAKARA的DRR820，機(jī)器是ABI7500。 看完附圖后，我的問題是 1. 為什么625、125倍濃度的擴(kuò)增曲線在一開始就出現(xiàn)峰，而ct值也分別只有15、25左右？ 2. 我以5倍濃度的梯度稀釋，為什么ct值會(huì)相差10左右？ 3. 忽略掉最低兩個(gè)濃度后的標(biāo)準(zhǔn)曲線slope：-12.24，Y-inter：55.271，R2：0.998，EFF%：17.551，這正常嗎？ 標(biāo)準(zhǔn)曲線.png 最后兩個(gè)濃度去掉以后的標(biāo)曲.png 625倍濃度（最高濃度）的擴(kuò)增曲線.png 125倍濃度的擴(kuò)增曲線.png 25倍濃度的擴(kuò)增曲線.png 5倍濃度的擴(kuò)增曲線.png |
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3樓2013-11-05 14:42:41
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jbj10015樓2013-11-07 10:33:59
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6樓2013-11-09 05:17:39
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