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xiaopeiliang金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
連接問(wèn)題求助高手
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最近在做一個(gè)連接，載體單酶切后，直接用T4連接酶連接涂板后居然不長(zhǎng)，去磷酸化后就更不長(zhǎng)了,更不要提連接目的片段的體系了，求解，糾結(jié)非常 |
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wangqi1107
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-11-06 10:17:27
xiaopeiliang: 金幣+2, ★有幫助, 載體對(duì)照沒(méi)有問(wèn)題，其它的也嘗試過(guò)啦 2013-11-06 22:52:22
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xiaopeiliang: 金幣+2, ★有幫助, 載體對(duì)照沒(méi)有問(wèn)題，其它的也嘗試過(guò)啦 2013-11-06 22:52:22
| 第一：做個(gè)沒(méi)有酶切的載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)做對(duì)照；第二：連接酶連其他東西看是不是失效；第三：抗生素有沒(méi)有搞錯(cuò)；第四：培養(yǎng)條件是否正確；第五：轉(zhuǎn)化條件是否正確。確定了這些問(wèn)題之后，肯定會(huì)找到原因。 |
4樓2013-11-06 08:55:15
gyesang
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2樓2013-11-06 01:42:58
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-11-06 08:28:22
xiaopeiliang: 金幣+2, ★有幫助, 嘗試不同去磷酸化量就是為了不過(guò)度去磷酸化，想找個(gè)合適的量，能夠讓載體自連幾個(gè)，不知道合理不，其它的都嘗試過(guò)啦，不是原因 2013-11-06 22:51:23
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-11-06 08:28:22
xiaopeiliang: 金幣+2, ★有幫助, 嘗試不同去磷酸化量就是為了不過(guò)度去磷酸化，想找個(gè)合適的量，能夠讓載體自連幾個(gè)，不知道合理不，其它的都嘗試過(guò)啦，不是原因 2013-11-06 22:51:23
| 確定T4 ligase是不是失效了。載體單酶切連接發(fā)生自連，去磷酸化是為了避免自連，當(dāng)然不會(huì)長(zhǎng)了。另外，你的感受態(tài)細(xì)胞是否好用，是否轉(zhuǎn)了為經(jīng)酶切的載體質(zhì)粒作為正對(duì)照？ |
3樓2013-11-06 07:44:23
bingdong05
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5樓2013-11-06 09:32:33
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