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175851279新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
細(xì)菌菌轉(zhuǎn)化問(wèn)題，跪求高手賜教
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拿了一株嗜麥芽窄食單胞菌單胞菌轉(zhuǎn)化GFP質(zhì)粒，做了三月未成功，轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒上有抗氨芐，紅霉素及林可霉素基因，這個(gè)菌本身就對(duì)抗生素抗性極強(qiáng)，三種抗生素混合濃度用到了600ug/ml，該菌才能被完全抑制，做化學(xué)轉(zhuǎn)化的時(shí)候一般都不會(huì)出現(xiàn)克隆，試了幾十次了，有一次出現(xiàn)了幾個(gè)單菌落，但沒(méi)有熒光，分析可能是超級(jí)菌突變株（每次都拿原始菌落做的感受態(tài)）。嘗試過(guò)各種不同的轉(zhuǎn)化條件，od，氯化鈣濃度，以及含有氯化鎂的培養(yǎng)液培養(yǎng)，但都沒(méi)有成功。 轉(zhuǎn)化步驟：挑取單菌落過(guò)夜培養(yǎng)，取500ul接種到50ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)到od為0.5-0.6，冰浴至零度，取10ml，4°離心，7000r 5min，拿出后再加入4ml 預(yù)冷20mM氯化鈣和30mM氯化鎂混合液重懸，相同轉(zhuǎn)速離心，后加入200ul 100mM氯化鈣重懸，冰浴1h，加5ul質(zhì)粒，冰浴30min ，42° 90s，冰浴3min，加入800ul soc培養(yǎng)液搖床培養(yǎng)或溫育1h，均勻涂到到抗性平板。 該質(zhì)粒是組成型表達(dá)。原始質(zhì)粒是puc19，內(nèi)插入GFP和三種抗生素抗性基因 |
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。你這個(gè)感受態(tài)的制備和我們很不一樣，我們的od應(yīng)該是在0.25-0.35之間啊。。。對(duì)數(shù)期早期。冰上放置30min，然后離菌4k rpm *10min，然后氯化鈣洗3次。最后甘油氯化鈣重懸。
2樓2013-11-06 13:05:43
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7樓2013-11-06 19:23:48
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