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chrisluxal新蟲 (小有名氣)
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[求助]
兩短片段連接并插入EGFP載體的解決方法
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最近準備將兩個段片段 A:150bp B:24bp 連接起來，再接入EGFP載體，進行下一步工作，現(xiàn)在遇到的問題是如何才能精確地不要多余堿基的情況下獲得這兩個片段，使其能夠正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯？ 望各位不吝賜教！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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chrisluxal: 金幣+20, ★★★很有幫助 2013-11-09 07:03:35
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就是設(shè)計2個引物：一個引物：包括一半你的24pb的堿基+你原來的引物序列，這樣就PCR產(chǎn)物就變成：12bp堿基加你的150bp的序列； 之后拿這個PCR產(chǎn)物當模板，再設(shè)計一個新的引物，加上另外的一半12bp堿基，再做一次PCR，這次就能得到你要的24bp+150bp的序列了。第2次的引物可以加上酶切位點和保護堿基。 其實引物太長沒什么關(guān)系，主要是TM值會太高，和你延伸溫度差不多的話就很難PCR了。而且你加太多的其他序列在你的引物里，你引物的特異性就不會很好了。如果分兩次還覺得引物太長，就分3次做，每次加8個bp。 |
21樓2013-11-09 05:21:56
2樓2013-11-07 23:48:30
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10樓2013-11-08 22:37:26
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