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chrisluxal新蟲 (小有名氣)
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[求助]
兩短片段連接并插入EGFP載體的解決方法
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最近準(zhǔn)備將兩個(gè)段片段 A:150bp B:24bp 連接起來，再接入EGFP載體，進(jìn)行下一步工作，現(xiàn)在遇到的問題是如何才能精確地不要多余堿基的情況下獲得這兩個(gè)片段，使其能夠正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯？ 望各位不吝賜教！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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chrisluxal: 金幣+20, ★★★很有幫助 2013-11-09 07:03:35
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就是設(shè)計(jì)2個(gè)引物：一個(gè)引物：包括一半你的24pb的堿基+你原來的引物序列，這樣就PCR產(chǎn)物就變成：12bp堿基加你的150bp的序列； 之后拿這個(gè)PCR產(chǎn)物當(dāng)模板，再設(shè)計(jì)一個(gè)新的引物，加上另外的一半12bp堿基，再做一次PCR，這次就能得到你要的24bp+150bp的序列了。第2次的引物可以加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。 其實(shí)引物太長沒什么關(guān)系，主要是TM值會(huì)太高，和你延伸溫度差不多的話就很難PCR了。而且你加太多的其他序列在你的引物里，你引物的特異性就不會(huì)很好了。如果分兩次還覺得引物太長，就分3次做，每次加8個(gè)bp。 |
21樓2013-11-09 05:21:56
2樓2013-11-07 23:48:30
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12樓2013-11-08 23:23:14
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10樓2013-11-08 22:37:26
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