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susizheng木蟲 (著名寫手)
我們是糖 甜到憂傷
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[交流]
什么是SD培養(yǎng)基？配置方法，篩選原理。我整理下了，免得大家老是來(lái)問(wèn)了。 已有10人參與
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好久沒(méi)來(lái)生物板塊了，主要是工作的原因，基本很少做生物方面的東西了， 最近偶爾來(lái)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，來(lái)看看自己越來(lái)越陌生的專業(yè)，興趣愛好，仿佛在生活面前變得如此蒼白， 不牢騷了，最近看板塊不少人問(wèn)起SD培養(yǎng)基，以及其篩選的原理，好像以前也有不少人問(wèn)，回答多次，今天根據(jù)自己的一點(diǎn)了解，通過(guò)實(shí)際的例子來(lái)簡(jiǎn)單介紹下SD培養(yǎng)基的配置及篩選原理。（養(yǎng)酵母是5年前了啊，也就養(yǎng)了半年的樣子，不知道還記得不） ============================================================= （1）SD培養(yǎng)基：（Synthetic Dropout Medium） 用于酵母繁殖和篩選的培養(yǎng)基 SD是含有鹽類、微量元素、維生素、氮源(不含氨基酸的酵母氮堿)和葡萄糖的合成基本培養(yǎng)基。 注意：氮源(不含氨基酸的酵母氮堿)是這種培養(yǎng)基用于篩選的關(guān)鍵，LB，YPD這種復(fù)合培養(yǎng)基因?yàn)橛玫搅私湍柑崛∥铮鞍纂�，基本是氮源全營(yíng)養(yǎng)的，肯定是不能用來(lái)做氮源篩選的============================================================= （2）SD培養(yǎng)基配方及配置方法： 注意，配置SD培養(yǎng)基必須先要知道你所用到的宿主酵母的基因型，至少要知道你用的酵母菌有哪些氨基酸缺陷。以我唯一接觸過(guò)的釀酒酵母為例 BY4741 [genotype, Mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0]) 以前經(jīng)常有人問(wèn)，這些字符時(shí)很么意思？其實(shí)很簡(jiǎn)單，也就是這個(gè)酵母菌是His，Leu，Met這三種氨基酸以及Ura缺陷型。至于后面數(shù)字，分別表示表達(dá)這些氨基酸的基因的幾個(gè)拷貝數(shù)缺失到剩余幾個(gè)拷貝的意思，例如his3Δ1 3個(gè)缺失到剩余一個(gè)，以此類推，雖然His不像后面的Leu，Met，Ura全部缺失了，但是在沒(méi)有添加組氨酸的SD中還是不能夠生長(zhǎng)的。（表述也許不完全科學(xué)，但也就是這么個(gè)意思） 總之，這個(gè)宿主菌有4個(gè)篩選標(biāo)記了，分別為His，Leu，Met，Ura 那SD培養(yǎng)基是如何配置呢？配置方法如下：（可以參考畢赤酵母操作手冊(cè)配方） SD培養(yǎng)基：（Synthetic Dropout Medium） 6.7 % YNB 2%葡萄糖 1 滅菌 850 ml 水 2 于 60 度下加入 50 ml 10×YNB，100 ml 10×D 3 添加氨基酸時(shí)，加入 10 ml 100×AA，混勻存于 4 度 4 如制備平板，于第一步加入 20 g 瓊脂粉 5 倒置平板，4 度放置幾個(gè)月 *100×AA 溶解 0.2 g組氨酸(Histidine) ， 1.0 g亮氨酸(Leudne) ，0.2 g甲硫氨酸(Methionine) ，0.2 g尿嘧啶(Uracil) 于100 ml的水中，過(guò)濾除菌，存于 4 度，可放 1 年 *10×YNB（13.4%酵母氮源堿（YNB）含硫酸銨不含氨基酸） 溶解134 gYNB 于1000 ml水中，過(guò)濾除菌，加熱至 YNB 完全溶解，存于 4 度�；蛘哂�34 gYNB（不含硫酸銨不含氨基酸），100 g 硫酸銨進(jìn)行配制，可放 1 年。 注意：我這個(gè)培養(yǎng)是針對(duì)我的宿主菌BY4741來(lái)配置的，各種SD培養(yǎng)基配方都一樣，唯一的是*100×AA 溶劑配置的方法不一樣。你的宿主菌是什么類型的基因型，有哪些氨基酸缺陷（或者嘧啶缺陷），你就添加什么樣的氨基酸。我的宿主菌是His，Leu，Met，Ura缺陷，因此我就添加這幾種氨基酸。 各類氨基酸添加濃度見下表（溶解在1 L水中即為*100×AA） 腺嘌呤(Adenine) 0.5g 丙氨酸(Alanine) 2.0g 精氨酸(ArSinine) 2.0g 天冬酰胺(Asparagine) 2.0g 天冬氨酸(AsPanic acid) 2.0g 半胱氨酸(Cysteine) 2.0g 谷氨酰胺(Glatamine) 2.0g 谷氨酸(Glutsmic acid) 2.0g 甘氨酸(GIycine) 2.0g 組氨組(Histidine) 2.0g 肌醇(Inositol) 2.0g 異亮氨酸(Isoleucine) 2.0g 亮氨酸(Leudne) 10.0g 賴氨酸(Lysine) 2.0g 甲硫氨酸(Methionine) 2.0g 對(duì)氨基苯甲酸(para-Aminobenzoic acid) 0.2g 苯丙氨酸(Phenylalanine) 2.0g 脯氨酸(Proline) 2.0g 絲氨酸(Serine) 2.0g 蘇氨酸(Threonine) 2.0g 色氨酸(Tryptophan) 2.0g 酪氨酸(Tyrosine) 2.0g 尿嘧啶(Uracil) 2.0g 纈氨酸(Valine) 2.0g 摘錄于Adams等人(1998)的資料。 ===================================================================== （3）SD培養(yǎng)基的篩選原理： 上面講到了SD培養(yǎng)基的配置原理及方法，那SD培養(yǎng)基又是怎么樣用來(lái)篩選的呢？全營(yíng)養(yǎng)的SD培養(yǎng)基配置要知道宿主菌的基因型，那么篩選用的SD培養(yǎng)基的配置就需要和你質(zhì)粒篩選標(biāo)記或者你整合的基因片段的篩選標(biāo)記來(lái)定了，如下圖，兩個(gè)經(jīng)典釀酒酵母質(zhì)粒： pDR195，負(fù)載型，這屬性，口水直流啊，輾轉(zhuǎn)拿到它，已經(jīng)被人改造了好幾次，我拿去測(cè)了序，所以它的每個(gè)堿基至今還在在我的vector里，一覽無(wú)遺啊，可惜我已經(jīng)將質(zhì)粒實(shí)物遺留在以前的實(shí)驗(yàn)室了，后來(lái)的人，也不會(huì)知道它的來(lái)之不易，早就清理掉了吧。 第二個(gè)質(zhì)粒，pδ-UB，出名哦Ro, D.-K., E. M. Paradise, et al. (2006). "☆Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast." Nature 。提到合成生物學(xué)，沒(méi)有不提Keasling 和他的青蒿素，這哥們就用到這個(gè)質(zhì)粒做整合。好吧，我承認(rèn)我曾經(jīng)很想擁有它，但那只是個(gè)念想，和課題一起破滅了。 這兩個(gè)質(zhì)粒無(wú)論是負(fù)載型的還是整合型的，篩選標(biāo)記都是URA，因此配置篩選培養(yǎng)基SD-Ura（Synthetic Dropout Medium－Uracil）：不加尿嘧啶。因?yàn)槿绻顷?yáng)性克隆的話，那么尿嘧啶缺陷可以通過(guò)質(zhì)粒上的URA基因進(jìn)行了補(bǔ)充。怎么樣？是不是和原核表達(dá)中，陽(yáng)性篩選很相像啊，其實(shí)本來(lái)就很簡(jiǎn)單，原理也都是相通的。 題外話：（1）作為宿主菌有幾個(gè)氨基酸缺陷型，一方面單基因表達(dá)時(shí)它有多種質(zhì)粒的選擇，另一方面多基因表達(dá)時(shí)，可多質(zhì)粒共表達(dá)。 （2）pδ-UB這個(gè)質(zhì)粒太牛了，雙酶切后得到的整合片段整合進(jìn)酵母基因組組氨酸hisG位置，立刻就產(chǎn)生了另外兩個(gè)hisG整合位點(diǎn)，如果再整合進(jìn)一個(gè)拷貝，整合位點(diǎn)就增加到三個(gè)，真是“一生二，二生三，三生萬(wàn)物”啊，所以這就導(dǎo)致很容易獲得基因的多拷貝整合的（好吧，和畢赤酵母整合型質(zhì)粒很像）。另外在特殊培養(yǎng)條件下，尿嘧啶篩選標(biāo)記還能脫落啊，這就太欺負(fù)人了，萬(wàn)能整合啊，所以Keasling做青蒿素（準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是其前體）時(shí)，就用這么個(gè)質(zhì)粒，整合了n個(gè)基因。 pDR.JPG pδ-UB.JPG SD培養(yǎng)基：（Synthetic Dropout Medium） 6.7 ‰ YNB 2%葡萄糖 [ Last edited by susizheng on 2014-3-27 at 17:25 ] |
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非常感謝。這些啟動(dòng)子的商業(yè)化質(zhì)粒嗎？我現(xiàn)在想設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，兩種基因在釀酒酵母中分別可控表達(dá)。一個(gè)確定了用GAL1啟動(dòng)子，并且有現(xiàn)成質(zhì)粒pYD1。另一個(gè)現(xiàn)在還找不到合適質(zhì)粒。我想這個(gè)質(zhì)粒是定點(diǎn)整合型的，使酵母中某個(gè)基因插入失活，同時(shí)引入新的非半乳糖控制的基因。也不知道這樣做能不能實(shí)現(xiàn)？ |
6樓2014-02-11 10:08:20
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