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lyyjackey新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
BamHI,SmaI平末端粘性末端連接問(wèn)題
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 最近一直在做工程菌構(gòu)建問(wèn)題，我的目的片段大約在1000bp左右，載體為7000左右，分別采用BamHI和SmaI對(duì)質(zhì)粒和載體進(jìn)行雙酶切，片段是連到T載體上的，測(cè)序正確。PS:酶切位點(diǎn)不能更換了。分別雙酶切后，割膠后膠回收。 連接體系如下： 片段：4uL 載體：1uL 連接酶：1uL（PS：TAKARA的solutionI連接酶） 在金屬浴上16度連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)。 感受態(tài)之前構(gòu)建的連T載體轉(zhuǎn)化效率都很高，目前還是在用同一批感受態(tài)。 已經(jīng)做了近一個(gè)多月了，一直是平板上什么都沒(méi)有，空空如也  。實(shí)驗(yàn)做得已不知所措，希望有這方面經(jīng)驗(yàn)的可以耐心予以解答，感激不盡。 |
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lyyjackey
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2樓2013-11-22 16:00:41
遠(yuǎn)方tony
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3樓2013-11-22 16:06:56
zh10246
鐵桿木蟲(chóng) (文壇精英)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-22 22:12:55
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| 平末端是效率低些，也不至于一個(gè)斑也沒(méi)有吧，轉(zhuǎn)化時(shí)建議做好陽(yáng)性對(duì)照，證實(shí)感受態(tài)是好的，確認(rèn)你的連接片段有東西，膠回收有的時(shí)候沒(méi)回收到，再做一次，如果不行，建議從頭開(kāi)始，重新設(shè)計(jì)引物，用合適的酶切位點(diǎn)，一個(gè)月沒(méi)做出來(lái)載體，有點(diǎn)長(zhǎng)了，這種實(shí)驗(yàn)一個(gè)星期就該做好。 |
4樓2013-11-22 19:12:05
5樓2013-11-22 21:28:59
lyyjackey
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6樓2013-11-24 07:51:32
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7樓2013-11-24 07:52:13
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8樓2013-11-24 08:25:52
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9樓2013-11-24 20:17:35
alicelchf
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10樓2013-11-24 20:39:06
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