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lyyjackey新蟲 (小有名氣)
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[求助]
BamHI,SmaI平末端粘性末端連接問題
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 最近一直在做工程菌構(gòu)建問題，我的目的片段大約在1000bp左右，載體為7000左右，分別采用BamHI和SmaI對質(zhì)粒和載體進(jìn)行雙酶切，片段是連到T載體上的，測序正確。PS:酶切位點(diǎn)不能更換了。分別雙酶切后，割膠后膠回收。 連接體系如下： 片段：4uL 載體：1uL 連接酶：1uL（PS：TAKARA的solutionI連接酶） 在金屬浴上16度連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)。 感受態(tài)之前構(gòu)建的連T載體轉(zhuǎn)化效率都很高，目前還是在用同一批感受態(tài)。 已經(jīng)做了近一個多月了，一直是平板上什么都沒有，空空如也  。實驗做得已不知所措，希望有這方面經(jīng)驗的可以耐心予以解答，感激不盡。 |
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lyyjackey
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8樓2013-11-24 08:25:52
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9樓2013-11-24 20:17:35
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10樓2013-11-24 20:39:06
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