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[求助]
有人做過雙報(bào)告基因的過表達(dá)質(zhì)粒載體么？ 已有1人參與
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目前實(shí)驗(yàn)安排是將一個(gè)基因片段A，將其加載于一個(gè)質(zhì)粒載體上后，E.coli擴(kuò)增后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但是為了方面檢測想做雙報(bào)告基因的過表達(dá)，加上GFP/Fluc之類的東西。目前這些方面一些問題很不清楚： 1、最重要的是，目前是否有人做“紅/綠熒光蛋白+熒光素酶+過表達(dá)功能基因（該處實(shí)際有三個(gè)蛋白的表達(dá)）”的質(zhì)粒？要是有的話，直接借來或者買來，加上自己的基因也行啊，O(∩_∩)O哈哈~。不過發(fā)現(xiàn)好多公司都是只有一種報(bào)告基因，然后可以加上目的片段的。在質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)中，要是表達(dá)這三種基因，是不是每種基因都有自己的啟動(dòng)子之類的，因此插入一個(gè)基因不是簡單的數(shù)學(xué)上1+1作用？而是還得設(shè)計(jì)相應(yīng)的結(jié)構(gòu)。 2、查了發(fā)現(xiàn)，有真核細(xì)胞表達(dá)載體和原核表達(dá)載體，我這里貌似用的先要在E.coli里大量擴(kuò)增，然后用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染，這種選擇的是那種質(zhì)粒載體，具體有哪一些具體的質(zhì)粒�。� 菜鳥希望大家多多提供意見和建議。 再次求助：有誰有可以表達(dá)雙報(bào)告基因的質(zhì)粒載體？跪求實(shí)驗(yàn)室名字或者一些文章，國內(nèi)的，O(∩_∩)O~ |
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biostar2009
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【答案】應(yīng)助回帖
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zhen022(gyesang代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-03-31 16:52:02
zhen022(gyesang代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-03-31 16:52:02
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你的問題我曾經(jīng)思考過， Promega作為Luciferase報(bào)告基因的大頭，他有一套質(zhì)粒叫做psiCheck，其中的psiCheck-2即在同一個(gè)骨架上有Renilla Luciferase和firefly Luciferase兩個(gè)報(bào)告基因。 仔細(xì)觀察這個(gè)載體的設(shè)計(jì)思路其實(shí)很簡單，就是兩個(gè)真核啟動(dòng)子，兩個(gè)polyA信號(hào)，包括兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本。你可以自己裝入你想要的基因，比如GFP、RFP之類的。 但是一個(gè)原則就是，為了防止在細(xì)菌中的同源重組，要求這些相同功能的元件不能用兩次，比如psiCheck-2中用的是SV40和HSV-TK兩個(gè)真核啟動(dòng)子，配套synthetic polyA和SV40 polyA signal。 |
5樓2014-03-13 13:24:03
yang0071
木蟲 (職業(yè)作家)
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2樓2013-12-03 08:30:26
clcl88
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhen022(gyesang代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-03-31 16:51:54
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhen022(gyesang代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-03-31 16:51:54
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我們做過類似的，以下僅供參考 1如果基因比較長應(yīng)該要多加啟動(dòng)子，我的是報(bào)告基因和表達(dá)基因前都有加啟動(dòng)子。每種基因的啟動(dòng)子應(yīng)該是有區(qū)別的，需要查相關(guān)文獻(xiàn)。 2我們一般先在E.coli構(gòu)建載體，BL21表達(dá)，大腸桿菌的表達(dá)載體和真核表達(dá)載體是有區(qū)別的，至于具體有哪些，你可以查閱文獻(xiàn)，根據(jù)需要選擇。如果你不需要大腸桿菌表達(dá)，就直接構(gòu)建真核表達(dá)載體然后侵染入真核。 僅供參考哦，也不一定對(duì)哈，若有不對(duì)請(qǐng)大俠指正哈！ |
3樓2013-12-03 08:58:53
武穆大成
木蟲 (著名寫手)
笨蛋
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6樓2015-09-23 16:30:37
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