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cherish-木金蟲 (小有名氣)
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[求助]
求果蔬中C4H，4CL 酶的測定方法或相關文獻 已有1人參與
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想要測定杏子中的C4H（肉桂酸羥化酶）、4CL（4-香豆酰-輔酶A 連接酶）,CHS（查爾酮合成酶），苦于沒有準確測定方法 ，望各位前輩有做過相關實驗的能不吝賜教，或者能給予相關外文文獻全文（中文文獻中的方法看過了但是不具體），謝謝各位了。 |
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50mM Tris-Hcl的配方網(wǎng)上都有，你可以搜一下，其他的巰基乙醇 105uL（這個就是買的原液），Vc 0.044025g, 6水氯化鎂 0.0813g, 亮肽素（我直接在管里加1 ml Tris-hcl, 短期用完的話放4度，長期的話可以分裝一下放-20）237.8uL，PVP 0.15g, 甘油10ml, 最后用Tris-hcl定容到100ml，因為亮肽素在4度環(huán)境能放一周吧，所以配好之后盡快測。4cl的也差不多 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
cherish-木9樓2013-12-24 11:28:37
【答案】應助回帖
★ ★ ★
cherish-木: 金幣+3, ★★★很有幫助 2013-12-18 16:45:11
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我只測C4H 4CL，參照-美洲南瓜(Cucurbitapepo)種皮發(fā)育形態(tài)觀察 及其相關酶活性測定，葡萄酒中酚酸及葡萄果實苯丙烷類代謝途徑研究，聽過這方面論文的，我測得菊花花瓣 C4H 參照Lamb 和Rubery等的方法。液氮研磨材料0.1g，加入10ml提取液（50 mmol/L Tris-HCl：pH8.9，15mmol/L β-巰基乙醇，4 mmol/L MgCl2，5mmol/L Vc，10μmol/L Leupeptin 亮肽素，1 mmol/L PMSF，0.15%: w/v PVP，10%甘油，混勻后超聲波破碎2 min，四層紗布過濾后，在4℃下以12000r./min 離心20min .取上清液為C4H粗酶提取液。酶反應液組成為：0.8ml 酶提取液，2.2ml緩沖液（2μmol/L 反式肉桂酸，50 mmol/L Tris-HCl: pH8.9，2μmol/L NADPNa2，5μmol/L G-6-PNa2）。25℃下振蕩30分鐘后，100r/min，加入100μL 6mol/L HCl終止反應，以12000r./min 離心10min，取上清液在340 nm處比色。參比為不加酶提取液（加入0.8 mL ddH2O）。OD值每1h變化0.01為一個酶活性單位，酶活性表示為：U/mg.prot.h 4CL 按照Knobloch和Halllbrock(1975)的方法。液氮研磨材料0.1g，加入10ml提取液(50mMTris-HCI: pH8.9，15mM β-疏基乙醇，5mM EDTA， 5mM Vc，10mM Leupeptin，lmM PMSF，0.15%: m/V PVP，10%甘油)，混勻后超聲波破碎2min，四層紗布過濾后，在4℃下以12000r./min 離心20min，取上清液即為4CL粗酶提取液。反應液體積為3mL，其中含酶液0.4mL，3ml(5µM對香豆酸，50µM ATP，1µM CoA-SH，15µM MgSO4•7H2O)， 40℃下反應10min后，在333nm處測定OD值，參比為不加酶提取液。OD值每1h變化0.0001為一個酶活性單位，酶活性表示為:U/mg.prot.h。 |
6樓2013-12-18 10:27:22
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3樓2013-12-04 10:13:26
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