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cherish-木金蟲 (小有名氣)
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[求助]
求果蔬中C4H，4CL 酶的測(cè)定方法或相關(guān)文獻(xiàn) 已有1人參與
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想要測(cè)定杏子中的C4H（肉桂酸羥化酶）、4CL（4-香豆酰-輔酶A 連接酶）,CHS（查爾酮合成酶），苦于沒(méi)有準(zhǔn)確測(cè)定方法 ，望各位前輩有做過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的能不吝賜教，或者能給予相關(guān)外文文獻(xiàn)全文（中文文獻(xiàn)中的方法看過(guò)了但是不具體），謝謝各位了。 |
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藍(lán)苑1988
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5樓2013-12-18 10:18:26
cherish-木
金蟲 (小有名氣)
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3樓2013-12-04 10:13:26
zybpxy
鐵桿木蟲 (著名寫手)
致齋大人
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4樓2013-12-04 11:11:19
藍(lán)苑1988
銀蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
cherish-木: 金幣+3, ★★★很有幫助 2013-12-18 16:45:11
cherish-木: 金幣+3, ★★★很有幫助 2013-12-18 16:45:11
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我只測(cè)C4H 4CL，參照-美洲南瓜(Cucurbitapepo)種皮發(fā)育形態(tài)觀察 及其相關(guān)酶活性測(cè)定，葡萄酒中酚酸及葡萄果實(shí)苯丙烷類代謝途徑研究，聽(tīng)過(guò)這方面論文的，我測(cè)得菊花花瓣 C4H 參照Lamb 和Rubery等的方法。液氮研磨材料0.1g，加入10ml提取液（50 mmol/L Tris-HCl：pH8.9，15mmol/L β-巰基乙醇，4 mmol/L MgCl2，5mmol/L Vc，10μmol/L Leupeptin 亮肽素，1 mmol/L PMSF，0.15%: w/v PVP，10%甘油，混勻后超聲波破碎2 min，四層紗布過(guò)濾后，在4℃下以12000r./min 離心20min .取上清液為C4H粗酶提取液。酶反應(yīng)液組成為：0.8ml 酶提取液，2.2ml緩沖液（2μmol/L 反式肉桂酸，50 mmol/L Tris-HCl: pH8.9，2μmol/L NADPNa2，5μmol/L G-6-PNa2）。25℃下振蕩30分鐘后，100r/min，加入100μL 6mol/L HCl終止反應(yīng)，以12000r./min 離心10min，取上清液在340 nm處比色。參比為不加酶提取液（加入0.8 mL ddH2O）。OD值每1h變化0.01為一個(gè)酶活性單位，酶活性表示為：U/mg.prot.h 4CL 按照Knobloch和Halllbrock(1975)的方法。液氮研磨材料0.1g，加入10ml提取液(50mMTris-HCI: pH8.9，15mM β-疏基乙醇，5mM EDTA， 5mM Vc，10mM Leupeptin，lmM PMSF，0.15%: m/V PVP，10%甘油)，混勻后超聲波破碎2min，四層紗布過(guò)濾后，在4℃下以12000r./min 離心20min，取上清液即為4CL粗酶提取液。反應(yīng)液體積為3mL，其中含酶液0.4mL，3ml(5µM對(duì)香豆酸，50µM ATP，1µM CoA-SH，15µM MgSO4•7H2O)， 40℃下反應(yīng)10min后，在333nm處測(cè)定OD值，參比為不加酶提取液。OD值每1h變化0.0001為一個(gè)酶活性單位，酶活性表示為:U/mg.prot.h。 |
6樓2013-12-18 10:27:22
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