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yangjingjing木蟲 (正式寫手)
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RetroQ質粒不同體系雙酶切，怎么會出現(xiàn)不同的帶？
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上圖左起Marker，RetroQ質粒，20u雙l酶切體系（1ug質粒），20ul雙酶切體系（1ug質粒），50ul雙酶切體系（5ug）~~~條帶的周圍被我切的，不是傳說中的雜帶， 20ul體系是一孔直接上樣，50ul體系的是分兩孔上樣的。為啥條帶不在同一位置呢？ 下圖左起Marker，RetroQ質粒，20u雙l酶切體系（1ug質粒），30ul雙酶切體系（1ug質粒），50ul雙酶切體系（1ug）（分兩孔），50ul雙酶切體系（3ug）（分兩孔），50ul雙酶切體系（5ug）（分兩孔）~~~~切了5h 我用的酶切位點是BamH1和EcoR1（二者間隔5bp），TAKARA的酶。這個到底是啥子情況 ��？為啥位置還有差別呢？是沒有酶切完全？ 20,50qie.JPG 2013.12.7R,R20,R30,R50,R50-3,R50-5=5.JPG |
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| 你的情況明顯是因為酶切不完全或者基本沒有切開。從你第一張圖上的質粒對照條帶位置基本與你50μl切5μg持平，說明沒有切開。做酶切建立反應體系時質粒的濃度不宜過高，一般是20μl體系里切1μg質粒。如果體系建得太濃，質粒的體積占總體積的比例會增加。在抽提質粒的過程中往往會有一些鹽難以除干凈。有些酶對鹽濃度是比較敏感的。而且質粒一般溶解在TE里，EDTA對酶切反應有抑制。用50μl里切5μg質粒有些多了，雖然多加酶或者延長時間也可以達到完全切開的效果。 |
2樓2013-12-11 09:24:04
cicelyzh
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4樓2013-12-11 13:28:17
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看來是我太貪心了~~可是有個奇怪的現(xiàn)象哈~我用的是生工的膠回收試劑盒，每次回收的酶切片段只有35ng/UL（30ul洗脫）左右的的濃度，今天都酶切四孔，4ug的，也是39ng/ul（40ul洗脫），這效率也太低了�。�？？ 5樓2013-12-11 23:09:51
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