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[求助]
cDNA克隆問(wèn)題求助！先謝過(guò)了！
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各位大神們，最近克隆碰到了坎兒，能不能過(guò)的去心里很沒(méi)底，懇請(qǐng)各位幫忙仔細(xì)分析下原因，謝過(guò)了！ 首先，我需要克隆的是一個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)，引物設(shè)計(jì)從ATG開(kāi)始，到終止子前結(jié)束。一共用了兩種克隆方法，gateway和topo克隆。兩次方法所使用的cDNA模板來(lái)自?xún)晒軜悠贰?br /> 然后，gateway克隆篩選到了4個(gè)陽(yáng)性菌落，topo克隆得到的更多。我用M13引物和M13-Rv測(cè)序確定片段的確插入進(jìn)去了。接著，我設(shè)計(jì)了分段引物，檢查是否有突變。這時(shí)問(wèn)題出現(xiàn)了，一共分段測(cè)序了3個(gè)質(zhì)粒，2個(gè)來(lái)自gateway,1個(gè)來(lái)自topo。測(cè)序結(jié)果卻顯示3個(gè)質(zhì)粒同時(shí)在同一地方測(cè)出了32個(gè)堿基的內(nèi)含子。由于不是3的倍數(shù)，應(yīng)該不是什么可變剪接。 看著辛辛苦苦做出的陽(yáng)性克隆，我迷茫了，到底是什么原因呢？模板問(wèn)題基本排除了，方法也用了兩種。卻得到這樣的結(jié)果。 最后還有一個(gè)問(wèn)題，我發(fā)現(xiàn)topo克隆出現(xiàn)反向插入的幾率還蠻高的，問(wèn)題是在提質(zhì)粒前我已經(jīng)M13和目的基因里的特異引物進(jìn)行了PCR，為什么還會(huì)出現(xiàn)反向插入呢？ 問(wèn)題稍微多了些，麻煩各位大神一定要幫幫忙啊，不勝感激！ |
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2樓2013-12-11 18:44:01
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