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請各位專業(yè)人士幫忙看看這個體外轉錄探針的實驗結果，為什么會這樣啊 已有1人參與
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做了兩個多星期的體外轉錄探針的實驗了，實驗結果一次比一次垃圾，不知道什么原因，請各位有經驗的朋友幫忙看看，非常感謝！ 沒有用試劑盒，轉錄體系是按照rna聚合酶的說明書配置：模板，酶，buffer，atp，ctp，utp，gtp，rna酶抑制劑，然后37度，2h，60v電泳15min。結果如下：單酶切質粒的時候感覺條帶很清晰的，回收后進行體外轉錄就一直沒有結果，開始的時候下面還有類似降解的條帶，后來連條帶都沒有了，只有模板的條帶，再到后面連電泳的膠都很臟。電泳用的loading buffer雖然不是專門跑rna的，但是卻是開了一管新的，專用道，沒有用于其他的電泳；電泳緩沖液也是用depc水配置的，（depc500ul+500ml水，搖床搖過夜，高壓滅菌60min），周圍沒有人做這個，如果有做的麻煩幫忙分析分析，萬分感激！ 單酶切質粒的電泳圖，右邊三個泳道全部回收到一管中 開始的結果與最左邊的泳道相同，從某一次成為這樣后就開始沒有條帶了 之后的轉錄結果，只有模版條帶，沒有轉錄產物 電泳之后這個結果，看著膠很臟，換了新的電泳緩沖液還是這樣 |
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fuyuandj86
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【答案】應助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2014-01-27 20:00:04
夏末憶雪: 金幣+25 2014-04-01 19:02:01
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夏末憶雪: 金幣+25 2014-04-01 19:02:01
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我沒有自己配過,都是用試劑盒,所以只能給點建議吧 1. 按理說產物應該比摸板多, 20ul的反應體系, 我用試劑盒是加1ug的摸板大概能有10ug的產物 2. 短的產物不太好轉錄, 比較短的(<500nt)需要延長反應時間2-4小時 3. 你可以加Dnase把摸板降解掉 3. 既然你剛開始做成功了,后來做不出來了就只能找區(qū)別了. 比如說你現在用的摸板和以前的摸板是同一批做的嗎 |
2樓2013-12-18 10:46:08
3樓2013-12-18 11:26:08
4樓2017-08-28 10:30:52
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