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[求助]
請各位專業(yè)人士幫忙看看這個(gè)體外轉(zhuǎn)錄探針的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為什么會這樣啊 已有1人參與
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做了兩個(gè)多星期的體外轉(zhuǎn)錄探針的實(shí)驗(yàn)了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一次比一次垃圾，不知道什么原因，請各位有經(jīng)驗(yàn)的朋友幫忙看看，非常感謝！ 沒有用試劑盒，轉(zhuǎn)錄體系是按照rna聚合酶的說明書配置：模板，酶，buffer，atp，ctp，utp，gtp，rna酶抑制劑，然后37度，2h，60v電泳15min。結(jié)果如下：單酶切質(zhì)粒的時(shí)候感覺條帶很清晰的，回收后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄就一直沒有結(jié)果，開始的時(shí)候下面還有類似降解的條帶，后來連條帶都沒有了，只有模板的條帶，再到后面連電泳的膠都很臟。電泳用的loading buffer雖然不是專門跑rna的，但是卻是開了一管新的，專用道，沒有用于其他的電泳；電泳緩沖液也是用depc水配置的，（depc500ul+500ml水，搖床搖過夜，高壓滅菌60min），周圍沒有人做這個(gè)，如果有做的麻煩幫忙分析分析，萬分感激！ 單酶切質(zhì)粒的電泳圖，右邊三個(gè)泳道全部回收到一管中 開始的結(jié)果與最左邊的泳道相同，從某一次成為這樣后就開始沒有條帶了 之后的轉(zhuǎn)錄結(jié)果，只有模版條帶，沒有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 電泳之后這個(gè)結(jié)果，看著膠很臟，換了新的電泳緩沖液還是這樣 |
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3樓2013-12-18 11:26:08
fuyuandj86
版主 (著名寫手)
己所不欲，勿施于人
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【答案】應(yīng)助回帖
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夏末憶雪: 金幣+25 2014-04-01 19:02:01
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我沒有自己配過,都是用試劑盒,所以只能給點(diǎn)建議吧 1. 按理說產(chǎn)物應(yīng)該比摸板多, 20ul的反應(yīng)體系, 我用試劑盒是加1ug的摸板大概能有10ug的產(chǎn)物 2. 短的產(chǎn)物不太好轉(zhuǎn)錄, 比較短的(<500nt)需要延長反應(yīng)時(shí)間2-4小時(shí) 3. 你可以加Dnase把摸板降解掉 3. 既然你剛開始做成功了,后來做不出來了就只能找區(qū)別了. 比如說你現(xiàn)在用的摸板和以前的摸板是同一批做的嗎 |
2樓2013-12-18 10:46:08
4樓2017-08-28 10:30:52
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