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fengmx2010木蟲 (著名寫手)
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[求助]
利用gateway載體做RNAi和overexpression出現(xiàn)的問題，懂質(zhì)粒構(gòu)造的進(jìn)�。。� 已有3人參與
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大家好，我現(xiàn)在想通過gateway技術(shù)構(gòu)建一種基因的RNAi和Overexpression表達(dá)載體。Destination plasmid是從國外購買的，這兩種載體的圖譜如下。 我已經(jīng)將目的基因通過帶有attB1和attB2位點(diǎn)的引物克隆得到了。BP反應(yīng)和LR反應(yīng)已經(jīng)做完了，依據(jù)致死基因和T-DNA外面鏈霉素抗性以及酶切驗(yàn)證，三個(gè)把關(guān)，我感覺目的基因已經(jīng)導(dǎo)入到正確位置了。 現(xiàn)在的問題是，我將純化好的質(zhì)粒想導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌中，選擇了A4（帶有利福平抗性）和AT15834野生型（無任何抗生素抗性）兩種菌株。可是怎么也篩不到陽性克隆，要么是污染，要么是什么都不長！我用的是鏈霉素（100ug/ml）和利福平（50ug/ml）平板，不知道是不是鏈霉素抗性基因不能在農(nóng)桿菌中表達(dá)��？卡那抗性能在農(nóng)桿菌中表達(dá)嗎？?jī)?nèi)含子之間的CmR又是在哪里表達(dá)的呢？我查了文獻(xiàn)，但是還是一頭霧水。關(guān)鍵是，有沒有一種方法，可以從基因序列直接推理出它在某種菌內(nèi)的表達(dá)情況？？ overexpression用 RNAi用，內(nèi)含子之間有一cat基因，LB RB之間有一kana抗性基因。 |
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