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細(xì)菌質(zhì)粒提取濃度太低求助 已有8人參與
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我質(zhì)粒提取已經(jīng)好幾次啦，每次提取出來濃度都是很低，我這是低拷貝質(zhì)粒，想提取出質(zhì)粒做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，求大俠指導(dǎo)一下并幫我分析一下為什么我提取的質(zhì)粒跑電泳結(jié)果顯示濃度太低？ 我曾經(jīng)加大過菌量可是結(jié)果卻提不出來，我的操作步驟都是嚴(yán)格按照天根小量中提試劑盒的說明書上來的，求高人指導(dǎo)下奧。 |
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yudaoqian88
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 回帖置頂 2014-03-28 16:39:44
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gyesang: 回帖置頂 2014-03-28 16:39:44
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質(zhì)粒提取數(shù)量少，只是質(zhì)�？截悢�(shù)低，裂解的菌液量少或者不充分，柱子回收效率不高的問題！ 有時(shí)候按照正規(guī)操作提取質(zhì)粒，也有提不出來的現(xiàn)象是，可能是質(zhì)粒丟失了-原因不知！ 樓主可以這樣： 1對凍存的原始菌液做抗性劃線培養(yǎng)，一來借助抗生素純化質(zhì)粒，二來也提高了菌活性液。 2隨機(jī)挑選幾個(gè)單克隆擴(kuò)搖，用報(bào)告基因或者啟動子序列作為Pcr對象進(jìn)行檢測或者合適酶的酶切檢測驗(yàn)證-可以放后面做，一般都對！ 3最大限度地提高菌體活性，先對正確的克隆小管擴(kuò)搖，然后再抽取新鮮菌液再擴(kuò)搖！ 4注意培養(yǎng)條件，培養(yǎng)時(shí)間不宜過長，一般8-12小時(shí)或15小時(shí)以內(nèi)吧！ 5按比例加大樣試劑總量，提取過程注意幾個(gè)細(xì)節(jié)，比如緩慢混勻，裂解后靜止等！ 6用60度左右預(yù)熱的水洗脫，洗脫兩遍，注意水的用量。 7可以加多水洗脫后，利用抽真空法濃縮質(zhì)粒！ 8有些盒子對質(zhì)粒大小也有要求，應(yīng)細(xì)看說明書！ [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
7樓2013-12-24 04:38:06
txy8469393
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gyesang: 回帖置頂 2014-03-28 16:41:35
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就是最普遍的堿法提取 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0），加RNase。 配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高壓滅菌15min ，貯存于4℃。 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。 配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。 溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。 配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?br /> 苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1） |
22樓2013-12-25 10:53:32
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10樓2013-12-24 09:28:33
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25樓2014-01-16 10:39:38
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2樓2013-12-23 16:23:12
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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低拷貝的質(zhì)粒確實(shí) 不是很好提取，所以菌液量一般是加倍的。但是菌液加倍后，相應(yīng)地溶液I、II、III也應(yīng)該加倍。也可以是分成兩管菌來裂解，離心后上清加入到同一個(gè)純化柱。 其實(shí)你的目的只是質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效率比連接產(chǎn)物要高，哪怕是濃度很低條帶很亮，也可以先試著轉(zhuǎn)化的，沒必要在提取這個(gè)問題糾纏這么久 |
8樓2013-12-24 09:24:07
9樓2013-12-24 09:24:57
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