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莊___木蟲 (初入文壇)
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[求助]
真核生物的基因構(gòu)建 已有3人參與
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| 請問能將一個質(zhì)粒直接導(dǎo)入真菌中表達，而不是線性化后導(dǎo)入嗎，直接導(dǎo)入會不會發(fā)生丟失，如果是要線性化導(dǎo)入的話，在18SrDNA處發(fā)生同源重組的話是不是會破壞18SrDNA的表達，使得真核生物不能生長? |
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莊___
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2樓2013-12-30 16:20:27
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一般pPIC系列基本都是在5‘AOX1處和HIS4處重組，當然你的基因如果和酵母的基因組存在同源區(qū)段自然就會有其他區(qū)段的重組。 其實線性化并不是發(fā)生同源重組的必須條件，直接把環(huán)狀質(zhì)粒導(dǎo)入酵母也會發(fā)生重組，但是是隨機重組，也就是說質(zhì)粒上所有和酵母同源區(qū)段都會有發(fā)生重組的可能，而線性化只不過利用是通過內(nèi)切酶切出了同源臂，而同源臂比其他區(qū)段相比更容易與酵母基因組上的相關(guān)區(qū)域發(fā)生單交換或者雙交換事件~從而與酵母特定的區(qū)域發(fā)生重組。 如果你的質(zhì)粒圖譜上沒有在酵母中穩(wěn)定復(fù)制的復(fù)制起始位點的話，質(zhì)粒自然不會單獨傳代，如果整合不上基因組就會隨著酵母不斷的擴增而丟失 你的質(zhì)粒是什么質(zhì)粒？是商品化的還是自己構(gòu)建的？18SrDNA及其周圍都屬于菌株十分保守的區(qū)域，至少我沒用過在18SrDNA整合的質(zhì)粒~~~ |
3樓2013-12-30 16:35:36
luwei13566
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額，你真厲害，~~這個我做不來~~，要接這個題首先你肯定對裂殖壺菌的代謝和整個基因圖譜非常清楚吧~~ 至于合適地方的選擇，我覺得首先你構(gòu)建質(zhì)粒在宿主菌的特定位置上整合以后不能影響宿主菌最基本的代謝~不然宿主菌就沒法長了。是不是可以在主要代謝以外的一些代謝分支上找一找看有沒有大小合適而且在基因組上拷貝數(shù)不低的一些酶的基因來設(shè)計同源臂？就好比畢赤酵母的AOX1一樣，整合上去不影響平常的代謝，只是在甲醇誘導(dǎo)的時候起效果~~ 其次，選擇的整合位點對你以后陽性轉(zhuǎn)化子的篩選有益~~比如說把宿主菌原有的同源區(qū)段替換后，宿主菌就出現(xiàn)了明顯的差異，可以通過這個差異來進行篩選，就好比pPIC9K的組氨酸利用缺陷型篩選，和Mut+與MutS篩選一樣~~~ 建議你把pPIC系列的質(zhì)粒多研究研究，特別是這些質(zhì)粒線性化位點的選擇，肯定有幫助~~而且一定要多看看裂殖壺菌報道的文獻，絕對有用！~ 畢竟我沒做過，只能說說我自己的想法，希望對你有幫助~~  |
5樓2013-12-30 21:45:31
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