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CRISPR/Cas9入選2013《科學(xué)》雜志十大進(jìn)展，仍難擺脫脫靶困擾
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2013年，研究者們發(fā)表多篇文章介紹CRISPR/Cas9系統(tǒng)，但是CRISPR/Cas9目前仍存在一個(gè)很嚴(yán)重且無法避免的問題，即潛在的脫靶效應(yīng)不可消除。 CRISPR/Cas9是由DNA切割酶Cas9和一段與靶 DNA片段匹配的20個(gè)核苷酸長度的短 RNA片段構(gòu)成。它的特點(diǎn)在于只需合成一個(gè)gRNA就能實(shí)現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas9蛋白不具特異性；編碼gRNA的序列不超過100bp，因此構(gòu)建較簡單方便。但是CRISPR/Cas9與靶位點(diǎn)識別的特異性主要依賴于gRNA與靠近PAM處10-12bp堿基的配對，而其余遠(yuǎn)離PAM處8-10bp堿基的錯配對靶位點(diǎn)的識別影響不大。麻省理工的張峰等曾證實(shí)，在基因組的其他位置即使有某一個(gè)、連續(xù)兩個(gè)或三個(gè)堿基與靶位點(diǎn)不同，gRNA也可以引導(dǎo)Cas9去切割，進(jìn)而造成脫靶。同時(shí)麻省總醫(yī)院的Jeffry D Sander證實(shí)，5個(gè)核苷酸的錯配都可以引起脫靶位點(diǎn)的突變，突變率有可能和靶位點(diǎn)一樣高，或甚至更高，進(jìn)而研究人員需要在他們的實(shí)驗(yàn)中考慮這些潛在的混雜效應(yīng)�；祀s效應(yīng)的存在一方面對細(xì)胞水平的打靶在基因功能的研究會造成混亂的局面，很難分析某功能的缺失是由哪個(gè)基因的敲除引起的，另一方面在動物模型應(yīng)用中，CRISPR/Cas9的脫靶性盡管可以通過多代交配的方式稀釋脫靶，但是這個(gè)過程會增加工作量和科研經(jīng)費(fèi)的開支，因此限制了CRISPR/Cas9的應(yīng)用。 目前最常用的基因修飾技術(shù)有TALEN和CRISPR/Cas9兩種。TALEN由TALE 蛋白和FokI 核酸內(nèi)切酶組成，利用TALE的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化組合蛋白，從而達(dá)到識別內(nèi)源性基因的目的。CRISPR/Cas9是由CRISPR相關(guān)基因和Cas9基因組成，Cas9會在gRNA的指引下，在完整基因組上的特定位點(diǎn)完成切割反應(yīng)，同時(shí)CRISPR/Cas9的切割也依賴于gRNA和基因組特定位點(diǎn)配對區(qū)5′端的PAM結(jié)構(gòu)，這也限制了gRNA的設(shè)計(jì)。過去有些研究者盡管知道CRISPR/Cas9的脫靶嚴(yán)重，但是由于構(gòu)建TALEN質(zhì)粒步驟的繁瑣使得他們還在TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)中徘徊，而現(xiàn)在FastTALE技術(shù)的出現(xiàn)使得TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建可以很容易地在1天內(nèi)完成，從而更能方便研究人員對TALEN技術(shù)的使用。 |
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