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中科院李勁松實驗室在Cell Stem Cell發(fā)文章揭示CRISPR/Cas9存在脫靶效應 已有19人參與
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中科院生化細胞所李勁松實驗室利用CRISPR/Cas9技術對引起小鼠白內障遺傳疾病的Crygc基因進行了研究，打靶的小鼠可以通過生殖細胞將修復的Crygc基因傳遞到下一代，因此由CRISPR/Cas9技術介導的遺傳疾病治療研究為人類基因治療提供了一條新的思路。但是，李勁松實驗室發(fā)現CRISPR/Cas9有嚴重脫靶現象，分別表現在以下兩個方面：一方面，在Crygc突變位置(與野生型基因相比，缺失一個堿基)共設計5條sgRNA并打靶發(fā)現，有2條sgRNA可以有效地切割野生型位點，顯示CRISPR/Cas9在此處有40%的脫靶率；另一方面，研究人員為了檢測脫靶另做了120個PCR和測序發(fā)現，確實有脫靶位點被切割，而且其中之一的脫靶位點是在核心序列只有11bp與基因組位置配對的情況下仍然被切割成功，此脫靶現象的存在使得CRISPR/Cas9在臨床應用上可能存在無法避免的安全隱患，同時使得基礎研究引入很多不確定性，所以CRISPR/Cas9在臨床應用和科學研究中受到很大局限。 CRISPR/Cas9的切割是通過向導RNA（sgRNA）與基因組位點之間20bp堿基的配對，再引導Cas9實現的，但是CRISPR/Cas9與靶位點識別的特異性主要依賴于sgRNA與靠近PAM(NGG)處10-12bp堿基的配對，其余遠離PAM處8-10bp堿基的錯配對靶位點的識別影響較小，而我們知道，要想在一個基因組中產生特異性位點至少需要16個堿基的配對才可實現特異。同時文獻中報道Cas9也可以識別NAG附近的序列并進行打靶，這些研究說明了CRISPR/Cas9存在嚴重的脫靶性，即該技術可以發(fā)生非特異性切割，引起基因組非靶向位點的突變，這會造成研究結果的不確定性以及研究工作的大量增加，這些問題嚴重地限制了CRISPR/Cas9的應用。 目前最常用的基因修飾技術有TALEN和CRISPR/Cas9兩種。TALEN由TALE 蛋白和FokI 核酸內切酶組成，利用TALE的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化組合蛋白，從而達到識別內源性基因的目的。CRISPR/Cas9是由CRISPR相關基因和Cas9基因組成，Cas9會在sgRNA的指引下，在完整基因組上的特定位點完成切割反應，同時CRISPR/Cas9的切割也依賴于sgRNA和基因組特定位點配對區(qū)5′端的PAM結構，使得sgRNA設計變得復雜。過去有些研究者盡管知道CRISPR/Cas9的脫靶嚴重，但是由于構建TALEN質粒步驟的繁瑣使得他們還在TALEN和CRISPR/Cas9技術中徘徊，而現在FastTALE技術的出現使得TALEN質粒的構建可以很容易地在1天內完成，從而更能方便研究人員對TALEN技術的使用。 |
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2樓2014-01-09 13:51:10
kaixinla168
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3樓2014-01-09 19:07:48
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4樓2014-01-10 23:54:56
lukecana
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5樓2014-01-11 02:21:05
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6樓2014-01-13 13:15:40
Coolly
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7樓2014-01-13 13:44:13
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8樓2014-01-13 15:01:35
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9樓2014-01-13 15:41:00
10樓2014-07-09 10:45:38
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