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中科院李勁松實驗室在Cell Stem Cell發(fā)文章揭示CRISPR/Cas9存在脫靶效應(yīng) 已有19人參與
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中科院生化細(xì)胞所李勁松實驗室利用CRISPR/Cas9技術(shù)對引起小鼠白內(nèi)障遺傳疾病的Crygc基因進(jìn)行了研究，打靶的小鼠可以通過生殖細(xì)胞將修復(fù)的Crygc基因傳遞到下一代，因此由CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的遺傳疾病治療研究為人類基因治療提供了一條新的思路。但是，李勁松實驗室發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9有嚴(yán)重脫靶現(xiàn)象，分別表現(xiàn)在以下兩個方面：一方面，在Crygc突變位置(與野生型基因相比，缺失一個堿基)共設(shè)計5條sgRNA并打靶發(fā)現(xiàn)，有2條sgRNA可以有效地切割野生型位點，顯示CRISPR/Cas9在此處有40%的脫靶率；另一方面，研究人員為了檢測脫靶另做了120個PCR和測序發(fā)現(xiàn)，確實有脫靶位點被切割，而且其中之一的脫靶位點是在核心序列只有11bp與基因組位置配對的情況下仍然被切割成功，此脫靶現(xiàn)象的存在使得CRISPR/Cas9在臨床應(yīng)用上可能存在無法避免的安全隱患，同時使得基礎(chǔ)研究引入很多不確定性，所以CRISPR/Cas9在臨床應(yīng)用和科學(xué)研究中受到很大局限。 CRISPR/Cas9的切割是通過向?qū)NA（sgRNA）與基因組位點之間20bp堿基的配對，再引導(dǎo)Cas9實現(xiàn)的，但是CRISPR/Cas9與靶位點識別的特異性主要依賴于sgRNA與靠近PAM(NGG)處10-12bp堿基的配對，其余遠(yuǎn)離PAM處8-10bp堿基的錯配對靶位點的識別影響較小，而我們知道，要想在一個基因組中產(chǎn)生特異性位點至少需要16個堿基的配對才可實現(xiàn)特異。同時文獻(xiàn)中報道Cas9也可以識別NAG附近的序列并進(jìn)行打靶，這些研究說明了CRISPR/Cas9存在嚴(yán)重的脫靶性，即該技術(shù)可以發(fā)生非特異性切割，引起基因組非靶向位點的突變，這會造成研究結(jié)果的不確定性以及研究工作的大量增加，這些問題嚴(yán)重地限制了CRISPR/Cas9的應(yīng)用。 目前最常用的基因修飾技術(shù)有TALEN和CRISPR/Cas9兩種。TALEN由TALE 蛋白和FokI 核酸內(nèi)切酶組成，利用TALE的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化組合蛋白，從而達(dá)到識別內(nèi)源性基因的目的。CRISPR/Cas9是由CRISPR相關(guān)基因和Cas9基因組成，Cas9會在sgRNA的指引下，在完整基因組上的特定位點完成切割反應(yīng)，同時CRISPR/Cas9的切割也依賴于sgRNA和基因組特定位點配對區(qū)5′端的PAM結(jié)構(gòu)，使得sgRNA設(shè)計變得復(fù)雜。過去有些研究者盡管知道CRISPR/Cas9的脫靶嚴(yán)重，但是由于構(gòu)建TALEN質(zhì)粒步驟的繁瑣使得他們還在TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)中徘徊，而現(xiàn)在FastTALE技術(shù)的出現(xiàn)使得TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建可以很容易地在1天內(nèi)完成，從而更能方便研究人員對TALEN技術(shù)的使用。 |
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9樓2014-01-13 15:41:00
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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6樓2014-01-13 13:15:40
Coolly
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7樓2014-01-13 13:44:13
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8樓2014-01-13 15:01:35
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