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常小晶鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR問題 已有5人參與
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| 最近出現(xiàn)一些問題，PCR總是彌散的情況，也耗時(shí)一個(gè)月了。不知道給位是否出現(xiàn)過這樣的現(xiàn)象，如果有希望能給予一些指導(dǎo)和幫助，不勝感激。鑒于所做的內(nèi)容比較多，以附件的形式上傳，希望大家能費(fèi)心點(diǎn)開閱讀，并群策群力。也看見小木蟲上面有這樣的現(xiàn)象出現(xiàn)，但是始終沒有最終的總結(jié)過哪里出現(xiàn)了問題，我也想借這個(gè)機(jī)會(huì)，自己出現(xiàn)的問題進(jìn)行總結(jié)，為以后的學(xué)弟學(xué)妹們做好總結(jié)，避免錯(cuò)誤繼續(xù)發(fā)生，令人抓狂。歡迎大家，踴躍討論，最終解決問題。附件中，也許有表述不清的，請(qǐng)見諒。 |
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2014-01-03 10:13:55, 7.61 M
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【答案】應(yīng)助回帖
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我的媽呀，我都不知道我為什么要下載，還仔細(xì)閱讀了。同學(xué)，我很佩服你解決問題的意志力，我還很佩服你的勇氣，敢用英文來寫，而且，英文真的是差得有水平啊。唉，我不知道該咋說了，幾乎每句話都有語法用詞的錯(cuò)誤。我要是認(rèn)識(shí)你，真想把你揪過來一句話一句話給你改。 回到實(shí)驗(yàn)上來，我本人也是做了很多很多PCR的，有時(shí)候明明做的結(jié)果還不錯(cuò)，換了別的樣品結(jié)果就很差，往往都是引物不太好引起的，或者引物工作條件比較苛刻，稍有不慎結(jié)果就很差。 |
4樓2014-01-03 13:45:35
yang0071
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2樓2014-01-03 11:10:24
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3樓2014-01-03 12:49:37
【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 回帖置頂 2014-01-04 00:30:47
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gyesang: 回帖置頂 2014-01-04 00:30:47
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你的工作做的很全面，對(duì)問題的考慮也很全面；但是就PCR這樣一個(gè)比較成熟的技術(shù)來講，你的研究有些過于復(fù)雜化了。在我以前的實(shí)驗(yàn)室，PCR條帶出現(xiàn)彌散一般都是很容易解決的。 先將我們以前的解決方法表述如下： 1.引物問題，這個(gè)一般是針對(duì)新合成的引物，對(duì)于已經(jīng)成功做出實(shí)驗(yàn)的就不會(huì)過多考慮；如果新引物在一般條件沒有獲得很好的擴(kuò)增（這個(gè)一般會(huì)用標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒模板），通過梯度溫度PCR仍然沒有很好的擴(kuò)增，那么就可以考慮重新設(shè)計(jì)引物。不過基于現(xiàn)在引物設(shè)計(jì)軟件的強(qiáng)大功能，一般的引物不會(huì)出現(xiàn)問題，除非擴(kuò)增的目的產(chǎn)物有很明顯的特殊性。 2.樣品問題，在引物沒有問題的前提下，樣品存在問題的可能性很高。作為模板的樣品，在添加進(jìn)PCR體系時(shí)很可能對(duì)整個(gè)的PCR體系產(chǎn)生影響；改變體系的PH，引入DNA酶的抑制物等等；一般建議PCR模板樣品是直接用水溶解的，樣品中不要含有太多的蛋白質(zhì)雜質(zhì). 3.實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)試劑的問題，這個(gè)兩樣一般不會(huì)出現(xiàn)問題，一臺(tái)儀器要是有問題就把以前做的很好的樣品作為對(duì)照就能解決啦；同理實(shí)驗(yàn)試劑也是的。 4.電泳問題，當(dāng)然這個(gè)問題很好說明，直接看你的Maker條帶是否清晰就行。 總結(jié)一下你的實(shí)驗(yàn)： 從你的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看，你已經(jīng)有過成功的實(shí)驗(yàn)，這樣的話你儀器，試劑，電泳應(yīng)該都是沒有問題；主要的問題就是在的模板樣品上面。 希望上面的分析對(duì)你的實(shí)驗(yàn)有幫助。 |
5樓2014-01-03 14:55:25
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