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常小晶鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR問題 已有5人參與
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| 最近出現(xiàn)一些問題，PCR總是彌散的情況，也耗時(shí)一個(gè)月了。不知道給位是否出現(xiàn)過這樣的現(xiàn)象，如果有希望能給予一些指導(dǎo)和幫助，不勝感激。鑒于所做的內(nèi)容比較多，以附件的形式上傳，希望大家能費(fèi)心點(diǎn)開閱讀，并群策群力。也看見小木蟲上面有這樣的現(xiàn)象出現(xiàn)，但是始終沒有最終的總結(jié)過哪里出現(xiàn)了問題，我也想借這個(gè)機(jī)會(huì)，自己出現(xiàn)的問題進(jìn)行總結(jié)，為以后的學(xué)弟學(xué)妹們做好總結(jié)，避免錯(cuò)誤繼續(xù)發(fā)生，令人抓狂。歡迎大家，踴躍討論，最終解決問題。附件中，也許有表述不清的，請見諒。 |
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2014-01-03 10:13:55, 7.61 M
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 回帖置頂 2014-01-04 00:30:47
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你的工作做的很全面，對問題的考慮也很全面；但是就PCR這樣一個(gè)比較成熟的技術(shù)來講，你的研究有些過于復(fù)雜化了。在我以前的實(shí)驗(yàn)室，PCR條帶出現(xiàn)彌散一般都是很容易解決的。 先將我們以前的解決方法表述如下： 1.引物問題，這個(gè)一般是針對新合成的引物，對于已經(jīng)成功做出實(shí)驗(yàn)的就不會(huì)過多考慮；如果新引物在一般條件沒有獲得很好的擴(kuò)增（這個(gè)一般會(huì)用標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒模板），通過梯度溫度PCR仍然沒有很好的擴(kuò)增，那么就可以考慮重新設(shè)計(jì)引物。不過基于現(xiàn)在引物設(shè)計(jì)軟件的強(qiáng)大功能，一般的引物不會(huì)出現(xiàn)問題，除非擴(kuò)增的目的產(chǎn)物有很明顯的特殊性。 2.樣品問題，在引物沒有問題的前提下，樣品存在問題的可能性很高。作為模板的樣品，在添加進(jìn)PCR體系時(shí)很可能對整個(gè)的PCR體系產(chǎn)生影響；改變體系的PH，引入DNA酶的抑制物等等；一般建議PCR模板樣品是直接用水溶解的，樣品中不要含有太多的蛋白質(zhì)雜質(zhì). 3.實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)試劑的問題，這個(gè)兩樣一般不會(huì)出現(xiàn)問題，一臺(tái)儀器要是有問題就把以前做的很好的樣品作為對照就能解決啦；同理實(shí)驗(yàn)試劑也是的。 4.電泳問題，當(dāng)然這個(gè)問題很好說明，直接看你的Maker條帶是否清晰就行。 總結(jié)一下你的實(shí)驗(yàn)： 從你的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看，你已經(jīng)有過成功的實(shí)驗(yàn)，這樣的話你儀器，試劑，電泳應(yīng)該都是沒有問題；主要的問題就是在的模板樣品上面。 希望上面的分析對你的實(shí)驗(yàn)有幫助。 |
5樓2014-01-03 14:55:25
zhaolf
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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我的媽呀，我都不知道我為什么要下載，還仔細(xì)閱讀了。同學(xué)，我很佩服你解決問題的意志力，我還很佩服你的勇氣，敢用英文來寫，而且，英文真的是差得有水平啊。唉，我不知道該咋說了，幾乎每句話都有語法用詞的錯(cuò)誤。我要是認(rèn)識(shí)你，真想把你揪過來一句話一句話給你改。 回到實(shí)驗(yàn)上來，我本人也是做了很多很多PCR的，有時(shí)候明明做的結(jié)果還不錯(cuò)，換了別的樣品結(jié)果就很差，往往都是引物不太好引起的，或者引物工作條件比較苛刻，稍有不慎結(jié)果就很差。 |
4樓2014-01-03 13:45:35
常小晶
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7樓2014-01-03 15:50:46
常小晶
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特別感謝您的解答，這是最靠譜和學(xué)術(shù)的一個(gè)。我先說明一下我的實(shí)驗(yàn)，由于最近一個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)這樣的問題，本人稍顯焦躁。上傳了一個(gè)我的報(bào)告，也是我的一些拙見，您給一些建議，PCR其實(shí)主要只有三個(gè)主要部分構(gòu)成：a 模板的制備 b PCR體系 c PCR程序 d 電泳體系 a,先說模板的制備：我也懷疑是模板的制備有問題，因?yàn)檫@個(gè)實(shí)驗(yàn)室是新建的，好多東西都可能存在不確定性，模板是最可能存在的問題，包括藥品和儀器，這樣我用試劑盒提取排除了一些因素。電泳，因?yàn)槲易龅陌撞朔N子，樣品很小，DNA含量雖不算很高，但是PCR足矣。排除了模板的問題。 b，PCR體系，PCR酶用的是全式金的，問過他們的銷售最近沒有市場上有酶問題的反應(yīng)，我去別的實(shí)驗(yàn)室做過，一共兩個(gè)，進(jìn)行我的酶體系的實(shí)驗(yàn)，顯示都沒有問題。 c，PCR程序，我所采用的程序是之前很好的程序，所以很長時(shí)間我都沒有將問題的重點(diǎn)放在這里面。始終覺得可能是引物出了毛病，我重新做的質(zhì)譜，還有電泳，以及多家公司合成比較，發(fā)現(xiàn)問題并沒有出現(xiàn)在這里。 d，電泳體系，我把別的實(shí)驗(yàn)室的DNA和引物用我們的酶體系以及電泳體系實(shí)驗(yàn)，效果很好，所以很多問題都排除了。 最近，我用相同的方法提取另一個(gè)白菜的品種的DNA，用另一對引物發(fā)現(xiàn)很好，平行實(shí)驗(yàn)很好。所以我才覺得可能在某種程度上說是PCR程序的問題。 我看也有很多在小木蟲上面提問的，都出現(xiàn)這樣的問題，但是最后都沒有回答是怎樣解決的，呵呵，所以很好奇，如果有出現(xiàn)這樣情況的，聊一聊，對以后也有幫助，僅此而已。謝謝 |
9樓2014-01-03 16:12:19
yang0071
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冷雁孤旅
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8樓2014-01-03 15:52:00
常小晶
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10樓2014-01-03 16:24:26
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