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sr_913金蟲 (初入文壇)
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[求助]
質(zhì)粒構(gòu)建出了奇怪的現(xiàn)象，實(shí)在找不到原因，請(qǐng)大家?guī)兔纯? 已有2人參與
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大家好！ 我現(xiàn)在在做Plk0.1-EGF載體重組質(zhì)粒的構(gòu)建。有幾個(gè)問題始終解決不了，找不到原因。 我是載體和目的基因（大小80bp）用EcoRI 和AgeI 37℃過(guò)夜雙酶切后，跑電泳，膠回收，然后用T4連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài). 做了連接的負(fù)對(duì)照，負(fù)對(duì)照長(zhǎng)了四五個(gè)菌落，連接產(chǎn)物大概長(zhǎng)十幾個(gè)菌落，但挑菌抽質(zhì)粒跑膠后，發(fā)現(xiàn)抽出來(lái)的質(zhì)粒比空載體小很多（估計(jì)2K左右）。這是什么原因呢？操作什么的應(yīng)該都沒有問題。另外，我們目前用的這個(gè)載體是前人改造過(guò)的，EcoRI 和AgeI酶切位點(diǎn)之間只有幾十bp大小的序列。 我看到 shRNA載體質(zhì)粒plko.1 mannual，上面說(shuō)用EcoR I 和Age I分別酶切。并且Age I是先切的，這是為什么，一定要按這順序切嗎？不可以一起雙切嗎？ [ Last edited by sr_913 on 2014-1-14 at 12:54 ] |
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sr_913: 金幣+3, ★有幫助, 謝謝這位蟲友，希望得到進(jìn)一步解答 2014-01-14 16:50:40
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sr_913(kx444555代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-01-15 08:33:48
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發(fā)現(xiàn)抽出來(lái)的質(zhì)粒比空載體小很多（估計(jì)2K左右）：環(huán)狀質(zhì)粒電泳的時(shí)候大小比線性的偏小。 可以雙切吧，可能以前的AgeI和EcoRI酶沒有共用buffer，所以分開切了 建議去測(cè)序，一切以測(cè)序結(jié)果為準(zhǔn)。 |
3樓2014-01-14 15:47:41
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