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從細(xì)菌提取一種功能蛋白，跑非變性PAGE膠無法進(jìn)入膠體 已有2人參與
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本人想從一種細(xì)菌的菌體中提取一個(gè)新的蛋白做質(zhì)譜鑒定，目前只知道該蛋白的功能，但是對于蛋白的種類、分子量大小等信息都不知道。菌體用含裂解緩沖液懸浮。裂解緩沖液含有5%的甘油、20mM的Tris-Hcl（pH8.0-8.8）、50mM的NaCl。然后用高壓破碎4次，壓力足夠大。破碎后裂解液經(jīng)過13000rpm離心5分鐘，取上清液直接上樣做蛋白電泳，期待目標(biāo)蛋白能分開。電泳采用非變性PAGE，膠濃度已調(diào)至最低4%，跑膠結(jié)束后檢測膠內(nèi)活性，檢測結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白在上樣槽底部，未進(jìn)入膠體。說明該蛋白的水溶解性很差。 后期為了提高溶解性，單獨(dú)考察了溫度（4℃、15℃、30℃）、pH（4.8-12.8）、NaCl（0-2M）濃度對該蛋白的溶解性是否有促進(jìn)作用，結(jié)果均失敗。 后來，添加分別單獨(dú)添加多種去污劑（Triton X-100、Triton X-114、CHAPS、LDAO、OG、DDM），添加時(shí)采用溶解濃度，即10倍的CMC濃度，但是效果也很差，只有DDM有微量的促進(jìn)作用，但是因效果太有限，并且太貴而終止。 問題是，在上述操作中，是否有什么不規(guī)范的操作？還有就是如何在保證蛋白活性的前提下，促進(jìn)難溶解蛋白的水溶性？謝謝！ 將依據(jù)回答者的幫助程度獎(jiǎng)勵(lì)金幣。 |
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2樓2014-02-14 08:22:18
3樓2014-02-14 08:29:27
yang0071
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4樓2014-02-14 09:01:29
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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你做質(zhì)譜為什么要跑非變性膠? 質(zhì)譜最后怎么都要把蛋白水解成多肽啊. 而且這蛋白的等電點(diǎn)也不知道,萬一蛋白在緩沖液里是帶正電荷的,那你用正常的電泳接法肯定進(jìn)不去膠啊. 再說了,你這蛋白是和其他蛋白形成復(fù)合體還是和核酸相互作用也不知道,你咋判斷是哪個(gè)條帶呢? 我覺得你要是能檢測膠內(nèi)活性,你就直接用和這個(gè)蛋白相互作用的底物或者什么東西把蛋白pulldown,然后跑變性膠送去做質(zhì)譜好了,甚至pulldown以后不跑膠也行 最后,具體回答你的問題來說,有時(shí)候加點(diǎn)BME破壞二硫鍵的形成,會(huì)幫助蛋白進(jìn)入非變性膠 |
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5樓2014-02-14 09:09:32
送紅花一朵 |
謝謝你的建議。 跑非變性膠是原因是要在保留該蛋白活性，這樣就可以在膠內(nèi)初步分離的同時(shí)檢測哪個(gè)條帶是目標(biāo)蛋白，因?yàn)樵跈z測膠內(nèi)活性的時(shí)候目標(biāo)蛋白條帶會(huì)顯色，而變性膠的話會(huì)因蛋白失活而無法使目標(biāo)蛋白條帶顯色。 關(guān)于電荷的問題，我曾經(jīng)將電泳的電極互換，結(jié)果上樣槽底部也沒有目標(biāo)蛋白條帶，說明該蛋白在緩沖液條件下還是帶負(fù)電的，另外，添加去污劑的條件下，會(huì)有少量目標(biāo)蛋白進(jìn)入膠體，也說明是負(fù)電的。 關(guān)于蛋白復(fù)合體和核酸互作的問題，沒有考慮到。希望能得到您的進(jìn)一步指導(dǎo)。是否需要添加核酸水解酶將破碎液中的核酸水解？ 關(guān)于pulldown的問題，我沒有做過，不知道步驟麻煩不？底物是一個(gè)重金屬，該蛋白可以改變該重金屬的價(jià)態(tài)而使得底物在蛋白條帶處顯色，不知道是否可以用pulldown的做法？ BME是指β-巰基乙醇，我以前也加過類似的東西，比如DTT，好像效果不明顯。我再添加BME試一試。 總之謝謝啦！  |
6樓2014-02-14 10:22:26
7樓2014-02-14 10:24:59
yang0071
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8樓2014-02-14 10:48:23
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