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從細菌提取一種功能蛋白，跑非變性PAGE膠無法進入膠體 已有2人參與
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本人想從一種細菌的菌體中提取一個新的蛋白做質(zhì)譜鑒定，目前只知道該蛋白的功能，但是對于蛋白的種類、分子量大小等信息都不知道。菌體用含裂解緩沖液懸浮。裂解緩沖液含有5%的甘油、20mM的Tris-Hcl（pH8.0-8.8）、50mM的NaCl。然后用高壓破碎4次，壓力足夠大。破碎后裂解液經(jīng)過13000rpm離心5分鐘，取上清液直接上樣做蛋白電泳，期待目標(biāo)蛋白能分開。電泳采用非變性PAGE，膠濃度已調(diào)至最低4%，跑膠結(jié)束后檢測膠內(nèi)活性，檢測結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白在上樣槽底部，未進入膠體。說明該蛋白的水溶解性很差。 后期為了提高溶解性，單獨考察了溫度（4℃、15℃、30℃）、pH（4.8-12.8）、NaCl（0-2M）濃度對該蛋白的溶解性是否有促進作用，結(jié)果均失敗。 后來，添加分別單獨添加多種去污劑（Triton X-100、Triton X-114、CHAPS、LDAO、OG、DDM），添加時采用溶解濃度，即10倍的CMC濃度，但是效果也很差，只有DDM有微量的促進作用，但是因效果太有限，并且太貴而終止。 問題是，在上述操作中，是否有什么不規(guī)范的操作？還有就是如何在保證蛋白活性的前提下，促進難溶解蛋白的水溶性？謝謝！ 將依據(jù)回答者的幫助程度獎勵金幣。 |
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cisong4樓2014-02-14 09:01:29
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