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銀蟲 (小有名氣)

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細胞工程（Cell engineering）是指主要以細胞為對象，應(yīng)用生命科學(xué)理論，借助工程學(xué)原理與技術(shù)，有目的地利用或改造生物遺傳性狀，以獲得特定的細胞、組織產(chǎn)品或新型物種的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。
◆研究對象：動植物細胞（原生質(zhì)體），也包括細胞器、染色體、細胞核、胚胎。
細胞凋亡（apoptosis）：指機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序性死亡。
◆細胞壞死（necrosis）：是細胞受到物理因素（如熱、輻射）、化學(xué)因素（如強酸、強堿、有毒物質(zhì)）或生物因素（如病原體）作用，引起細胞無序變化的死亡過程。
  貼壁型生長細胞:附著在某一固相支持物表面才能       生長的細胞。
懸浮型生長細胞:不必附著于固相支持物表面，在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。
二）懸浮生長型
   培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機械方法使之保持懸浮狀態(tài)生長的細胞叫懸浮生長型細胞。
特點：不貼附在支持物上生長，胞體圓形。
優(yōu)點：在培養(yǎng)液中生長空間大，提供數(shù)量大；
   傳代方便(只需稀釋而不需消化處理)；
   可長時間生長，繁殖旺盛便于做細胞代謝研究。
缺點：觀察不方便
   很多細胞不能懸浮生長

  懸浮生長型細胞與貼附生長型細胞相比，  具有哪些優(yōu)點和缺點？
優(yōu)點：在培養(yǎng)液中生長空間大，提供數(shù)量大；
   傳代方便(不需消化)；
   可長時間生長，繁殖旺盛便于做細胞代謝研究。
缺點：觀察不方便
   很多細胞不能懸浮生長

細胞在體外生長時具有貼附、接觸抑制和密度依賴性三大特點。

接觸抑制可作為區(qū)別正常細胞與腫瘤細胞的標志之一。
正常細胞生長密度過大時，細胞變得擁擠，生存空間消失，同時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物被逐漸消耗掉，代謝產(chǎn)物增多，細胞停止分裂增殖，這種特性稱為密度抑制

思考題4：體外培養(yǎng)的細胞具有哪些生長特點？
   體外培養(yǎng)細胞重要的生長特點有：貼附并伸展以及接觸抑制和生長的密度依賴性。
   貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細胞的基本生長特點。大多數(shù)細胞在體外均附著于一定的底物而生長。培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前均似圓球樣，當與底物貼附后，細胞逐漸伸展而形成一定的形態(tài)
接觸抑制是由于細胞相互接觸而抑制細胞運動性的現(xiàn)象。正常細胞不會發(fā)生相互重疊，而是呈單層細胞生長。
   密度抑制是當細胞密度達到一定程度后，營養(yǎng)相對缺乏，代謝產(chǎn)物增多，細胞受營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響而發(fā)生的現(xiàn)象，此時細胞停止分裂。

干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。

思考題5：體外培養(yǎng)細胞的生命期包括哪幾個時期？  每一時期的細胞具有哪些特點？
包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。
原代培養(yǎng)期：細胞移動活躍；可見細胞分裂，但不旺盛；呈二倍體核型；與體內(nèi)原組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能基本相似。
傳代培養(yǎng)期：細胞增殖旺盛，并維持二倍體核型。
衰退期：細胞增殖減慢，輪廓逐漸增強，走向       衰退凋亡。

生物學(xué)意義：
原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細胞進行培養(yǎng)，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段；
作為傳代培養(yǎng)的基本條件；
可直接服務(wù)于臨床實踐，進行藥物測試。例如，用從手術(shù)中切除的腫瘤細胞進行原代培養(yǎng)，然后進行抗癌藥物的篩選，根據(jù)腫瘤細胞對化療藥物的敏感性來選擇最有效的化療方案

二、體外培養(yǎng)細胞有哪些類型？其生長特點有什么區(qū)別？
         成纖維型細胞
貼壁型細胞上皮型細胞
         游走型細胞
         多形型細胞

懸浮型細胞
生長特點從形態(tài)、生長形式等加以區(qū)別比較

潛伏期、指數(shù)生長期和停滯期。
細胞有代謝及運動，但無增殖。細胞分裂相增多時，標志細胞進入指數(shù)生長期
  細胞增殖最旺盛階段，分裂相增多，活力最佳
  細胞不增殖，有代謝活動。
血清存在的問題 1. 存在有害于細胞生長和繁殖的物質(zhì)。如補體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子。
2. 成分不明確，影響對結(jié)果的分析。
3. 不同動物、不同批次的血清和活性差別較大，使培養(yǎng)的結(jié)果不穩(wěn)定。

問題1:體外培養(yǎng)的細胞需要哪些物質(zhì)？
   水、糖、氨基酸、維生素、無機離子和微量元素、血清和促生長因子。

問題2：體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞需要在什么環(huán)境下生長？如何獲得這些環(huán)境？
溫度：36.5±0.5℃
pH：7.1~7.3
滲透壓：260~320mOsm/kg
氣體：95% O2和5%CO2

微生物污染細胞后的現(xiàn)象對比：
細菌：增殖快，短時間在數(shù)量上壓過細胞產(chǎn)生毒素殺死細胞。
真菌：種類繁多，形態(tài)各異，呈白色或淺黃色小點，飄浮于培養(yǎng)液面，肉眼可見。
支原體、病毒：無致死毒性，對細胞形態(tài)和機能的影響是長期的、緩慢的和潛在的，短時間內(nèi)不易被發(fā)現(xiàn)。

問題2：胎牛血清在細胞培養(yǎng)中起什么作用？
1.補充培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)物質(zhì)；
2.提供激素和各種生長因子；
3. 提供結(jié)合蛋白；
4. 含有生長基質(zhì)成分使細胞易貼附在培養(yǎng)器皿上；
5. 對培養(yǎng)中的細胞起到保護作用。

問題7：組織塊培養(yǎng)3~5天后換液的目的是什么？
1、補充營養(yǎng)；
2、去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。

問題8：細胞傳代培養(yǎng)和細胞分裂之間有何關(guān)系？細胞傳代培養(yǎng)1次是細胞分裂1次嗎？
   細胞一代中，細胞分裂多次，細胞數(shù)量增加，達到飽和密度時進行傳代培養(yǎng)。

問題9：微生物的污染主要包括哪些類型？怎樣判斷培養(yǎng)的細胞污染了何種微生物？
細菌、真菌、支原體和病毒污染。
細菌污染：培養(yǎng)液變混濁，胞內(nèi)顆粒增多，細胞變圓脫落死亡。
真菌污染：培養(yǎng)液中漂浮白色或淺黃色的小點，鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲。
支原體污染：相差顯微鏡觀察，地衣紅染色觀察，熒光染色法觀察，電鏡檢測，培養(yǎng)檢測。
病毒污染：電鏡檢測，RT-PCR。

體外受精的早期胚胎在體外發(fā)育中，往往會停止在某一階段不再發(fā)育，這種現(xiàn)象稱為發(fā)育阻滯

同核體（homokaryon）：由同一基因型親本細胞融合而來。
異核體（heterokaryon）：由不同基因型親本胞融合而來。

二、細胞融合的主要過程
細胞在誘導(dǎo)劑或正弦電場作用下凝聚，彼此靠近；
兩個相鄰細胞之間的質(zhì)膜相互融合；質(zhì)膜上的受體、糖蛋白等質(zhì)膜成分在融合后的質(zhì)膜上重新分布；
細胞質(zhì)發(fā)生融合；
細胞核融合，形成融合細胞

人工誘導(dǎo)細胞融合的方法：
病毒誘導(dǎo)：滅活的仙臺病毒化學(xué)誘導(dǎo)：PEG、Ca2+、溶血卵磷脂等物理誘導(dǎo)：電誘導(dǎo)

常用方法有：抗藥性篩選；營養(yǎng)缺陷型篩選；溫度敏感型篩選等。

抗體是由B細胞受抗原刺激后所分泌的蛋白質(zhì)

B淋巴細胞接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能       短命細胞          保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期
常用克隆化方法：有限稀釋法  軟瓊脂平板法  顯微操作法

問題：整個制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?
第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細胞，但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞。
第二次篩選（克隆化培養(yǎng)和抗體檢測）：篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞。

懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點：
操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧效果比較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計和實際操作中可以借鑒許多細菌發(fā)酵的經(jīng)驗。
◆懸浮培養(yǎng)的缺點：
不能采用灌流培養(yǎng)，導(dǎo)致細胞密度較低，另外只有少數(shù)細胞適合懸浮培養(yǎng)。

貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點：
容易更換培養(yǎng)液；容易采用灌注式培養(yǎng)、不需過濾系統(tǒng)；同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細胞的比例、適用于所有類型細胞。
◆貼壁培養(yǎng)的缺點：
擴大培養(yǎng)比較困難，投資大，占地面積大；不能有效監(jiān)測細胞的生長。

動物細胞貼壁生長的主要環(huán)節(jié)有哪些？
1、潛伏期：
（1）游離期：接種的細胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)。
（2）吸附期：不同類型的細胞貼壁時間有所差異。
2、對數(shù)生長期：懸浮細胞貼壁后經(jīng)過一段停滯后開始分裂。隨著細胞數(shù)量增多，細胞間開始接觸并連接成片，出現(xiàn)接觸性抑制。
3、停滯期：細胞長滿載體表面，隨著營養(yǎng)物消耗和代謝物積累，密度抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，細胞開始退化。如不及時傳代培養(yǎng)，細胞脫落死亡

（二）大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式
1、分批式培養(yǎng)2、流加式培養(yǎng)3、半連續(xù)式培養(yǎng)4、連續(xù)式培養(yǎng) 5、灌注式培養(yǎng)
2、動物細胞培養(yǎng)的缺點：
①體外培養(yǎng)的動物細胞對營養(yǎng)的要求較高。
②動物細胞生長緩慢，對環(huán)境條件要求嚴格。
③體外培養(yǎng)的細胞與體內(nèi)生長的細胞存在或多或少的差異
2、培養(yǎng)方法的發(fā)展
◆雙蓋片懸滴培養(yǎng)法 ◆旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)的方法 ◆灌注小室培養(yǎng)法
良好微載體的特點：
1、好的生物相容性：無毒無害；2、好的黏附性：適于細胞附著、伸展和增殖，一般帶正電荷；3、大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一； 4、良好的傳質(zhì)性能；5、強的機械性能：保護細胞、重復(fù)利用；6、好的熱穩(wěn)定性：適合高壓蒸汽滅菌。

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