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蒲睛琉弈新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助：猴的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)問題 已有1人參與
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最近在做猴的外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，作為新手，有很多問題要向各位有經(jīng)驗(yàn)的朋友請(qǐng)教。 我用的是TBD的猴單個(gè)核細(xì)胞分離液。無菌注射器采血，轉(zhuǎn)移至15mL離心管后進(jìn)行分離。組織稀釋液1:1稀釋后，轉(zhuǎn)移至淋巴細(xì)胞分離液上層，2000rpm離心30min。離心后有的看不出來白細(xì)胞層，就吸出大部分中間白色霧狀層。加洗滌液1500rpm離心10min，沉淀重復(fù)洗滌2次。1640培養(yǎng)基重懸種板用于PHA刺激的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。 我的問題主要在于： 1.將血液加到淋巴細(xì)胞分離液上層離心后，很多時(shí)候都看不到明顯的白細(xì)胞層。而且中間分離液層有些懸有紅細(xì)胞，這樣提取的就混有較多紅細(xì)胞。如何才能較少紅細(xì)胞的量？ 2.在細(xì)胞種板后我發(fā)現(xiàn)幾乎每個(gè)孔都有桿狀的東西，應(yīng)該是細(xì)菌。。作為細(xì)胞族這是無法容忍的呀。請(qǐng)問各位有經(jīng)驗(yàn)的大神，如何才能保證無菌？因?yàn)槲业腜BMC分離過程中都是細(xì)胞房外，這個(gè)過程有哪些步驟應(yīng)該注意以防染菌？配制肝素鈉抗凝劑的時(shí)候我沒有用無菌水。。在稱量肝素鈉和PHA的時(shí)候這些藥物都是暴露在空氣中的，會(huì)不會(huì)也會(huì)增加染菌的幾率呢？ 3.可能因?yàn)槿揪�，我的PHA 10μg/mL刺激72h后細(xì)胞增殖率才＞100%，并沒有達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)道的200%~300%或更高。請(qǐng)問各位做過這個(gè)實(shí)驗(yàn)的朋友一般PHA刺激60多個(gè)小時(shí)和72個(gè)小時(shí)有沒有差別？PHA刺激的話增殖率的正常范圍是多少？ |
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yipan 
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2樓2014-04-18 16:56:39
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