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[求助]
有關(guān)質(zhì)粒提取的問題。。。急！��！ 已有2人參與
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| 小弟最近做red重組，用的質(zhì)粒pkd46（6329bp），每次提完跑膠都在12000左右，應(yīng)該是形成了二聚體，單酶切后跑膠大小正常。請問下：質(zhì)粒形成二聚體會影響質(zhì)粒上基因的表達(dá)嗎？ |
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yipan 
銅蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
liulugang: 金幣+2, ★有幫助 2014-02-19 13:30:50
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| 細(xì)菌質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體的自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，只有酵母的殺傷質(zhì)粒(killerplasmid)已知是RNA分子。環(huán)形雙鏈DNA分子有三種構(gòu)型。第一種是共價閉合環(huán)狀DNA(covalently close circular DNA，ccc DNA)，它的兩條鏈都保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常呈超螺旋構(gòu)型。第二種是開環(huán)DNA(open circularDNA，oc DNA)，它的雙鏈中的一條保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條單鏈上有一到幾個切口。第三種是線狀DNA，這種質(zhì)粒的雙鏈斷裂呈線狀。這三種構(gòu)型的同一種質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中電泳時，出現(xiàn)不同的遷移速率，走得最快的是超螺旋構(gòu)型，其次是線性構(gòu)型，最慢的是開環(huán)構(gòu)型。細(xì)菌細(xì)胞中質(zhì)粒的數(shù)目有很大差異。多的每個細(xì)胞里可以達(dá)幾十乃至幾百份拷貝，少的則只有一到幾份拷貝。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒稱為松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)，獨(dú)立于細(xì)菌細(xì)胞而自主復(fù)制;低拷貝數(shù)的質(zhì)粒一般是嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringent plasmid)，它們的復(fù)制隨細(xì)菌染色體的復(fù)制同步進(jìn)行。實驗證明，同一個大腸桿菌細(xì)胞里一般不會同時有兩種不同的質(zhì)粒，這是質(zhì)粒不相容性(plasmid incompatibility)。在細(xì)菌細(xì)胞增殖過程中，其中必有一種會被逐漸排斥。這樣的兩種質(zhì)粒被稱為不相容質(zhì)粒。帶有外源DNA的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞以后，會產(chǎn)生一系列生理效應(yīng)，影響自身的穩(wěn)定性。特別是表達(dá)型的質(zhì)粒載體，外源基因的表達(dá)會使宿主細(xì)胞的生長速率下降，以及質(zhì)粒載體的丟失等。這種質(zhì)粒的不穩(wěn)定性包括分離不穩(wěn)定性(segregational instability)和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性(structural instability)，前者指細(xì)菌細(xì)胞分裂過程中，有一個子細(xì)胞沒有得到質(zhì)�？截悾罱K使質(zhì)粒丟失的細(xì)胞成為優(yōu)勢群體;后者主要是指由于轉(zhuǎn)座和重組，使質(zhì)粒DNA重排或缺失。影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素有：①宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷增加 質(zhì)粒載體可使宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷加重，有的能延長其世代時間15%左右。質(zhì)粒載體的大小同宿主細(xì)胞生長延緩的程度呈正相關(guān)，這可能是由于質(zhì)粒載體相對分子質(zhì)量大，則對宿主細(xì)胞DNA復(fù)制的負(fù)荷更大的緣故。同樣，宿主細(xì)胞如維持質(zhì)粒載體中外源基因的表達(dá)活性，勢必在DNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯上承受更多的額外負(fù)擔(dān)。②細(xì)胞中所含質(zhì)粒載體的拷貝數(shù) 細(xì)胞中所含質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)各不相同，也是影響質(zhì)粒丟失的一個因素�？截悢�(shù)差別不大時，質(zhì)粒載體相對地穩(wěn)定;拷貝數(shù)相差懸殊，則很容易造成一些細(xì)胞丟失質(zhì)粒，并逐漸發(fā)展為優(yōu)勢群體。③宿主細(xì)胞DNA重組系統(tǒng)的作用 質(zhì)粒載體之間發(fā)生重組會形成二聚體、三聚體，甚至四聚體等所謂的質(zhì)粒寡聚體(plasmid oligomer)，其穩(wěn)定性比單體差。此外，質(zhì)粒載體中外源DNA片段的大小同質(zhì)粒寡聚化的程度也密切相關(guān)。 |
2樓2014-02-18 13:24:38
3樓2014-02-18 14:17:20
yipan
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4樓2014-02-18 14:18:30
朱多龍
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2014-02-18 18:01:36
liulugang: 金幣+3, ★★★很有幫助 2014-02-19 13:30:39
liulugang: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-02-19 13:33:23
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2014-02-18 18:01:36
liulugang: 金幣+3, ★★★很有幫助 2014-02-19 13:30:39
liulugang: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-02-19 13:33:23
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質(zhì)粒自連一般會影響蛋白的表達(dá)，而且質(zhì)粒自連后比較大，不太穩(wěn)定，而且不容易電轉(zhuǎn)化。你是需要表達(dá)那三個功能蛋白的，不建議用自連的質(zhì)粒去實驗。最好是用原先正確的質(zhì)粒。如你所說可以將自連的質(zhì)粒單切，單切后做一下簡單的自連接，再轉(zhuǎn)化，從而篩到正確的質(zhì)粒，也有助于實驗的進(jìn)行。 |
5樓2014-02-18 14:23:36
6樓2014-02-18 15:04:22
7樓2014-02-18 16:05:23
8樓2014-02-18 16:06:21
9樓2014-02-18 16:33:17
10樓2014-02-18 18:33:06
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