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有關(guān)質(zhì)粒提取的問題。。。急�。�！ 已有2人參與
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| 小弟最近做red重組，用的質(zhì)粒pkd46（6329bp），每次提完跑膠都在12000左右，應該是形成了二聚體，單酶切后跑膠大小正常。請問下：質(zhì)粒形成二聚體會影響質(zhì)粒上基因的表達嗎？ |
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9樓2014-02-18 16:33:17
yipan 
銅蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應助回帖
★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
liulugang: 金幣+2, ★有幫助 2014-02-19 13:30:50
感謝參與，應助指數(shù) +1
liulugang: 金幣+2, ★有幫助 2014-02-19 13:30:50
| 細菌質(zhì)粒是獨立于細菌染色體的自主復制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，只有酵母的殺傷質(zhì)粒(killerplasmid)已知是RNA分子。環(huán)形雙鏈DNA分子有三種構(gòu)型。第一種是共價閉合環(huán)狀DNA(covalently close circular DNA，ccc DNA)，它的兩條鏈都保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常呈超螺旋構(gòu)型。第二種是開環(huán)DNA(open circularDNA，oc DNA)，它的雙鏈中的一條保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條單鏈上有一到幾個切口。第三種是線狀DNA，這種質(zhì)粒的雙鏈斷裂呈線狀。這三種構(gòu)型的同一種質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中電泳時，出現(xiàn)不同的遷移速率，走得最快的是超螺旋構(gòu)型，其次是線性構(gòu)型，最慢的是開環(huán)構(gòu)型。細菌細胞中質(zhì)粒的數(shù)目有很大差異。多的每個細胞里可以達幾十乃至幾百份拷貝，少的則只有一到幾份拷貝。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒稱為松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)，獨立于細菌細胞而自主復制;低拷貝數(shù)的質(zhì)粒一般是嚴緊型質(zhì)粒(stringent plasmid)，它們的復制隨細菌染色體的復制同步進行。實驗證明，同一個大腸桿菌細胞里一般不會同時有兩種不同的質(zhì)粒，這是質(zhì)粒不相容性(plasmid incompatibility)。在細菌細胞增殖過程中，其中必有一種會被逐漸排斥。這樣的兩種質(zhì)粒被稱為不相容質(zhì)粒。帶有外源DNA的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細胞以后，會產(chǎn)生一系列生理效應，影響自身的穩(wěn)定性。特別是表達型的質(zhì)粒載體，外源基因的表達會使宿主細胞的生長速率下降，以及質(zhì)粒載體的丟失等。這種質(zhì)粒的不穩(wěn)定性包括分離不穩(wěn)定性(segregational instability)和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性(structural instability)，前者指細菌細胞分裂過程中，有一個子細胞沒有得到質(zhì)�？截�，最終使質(zhì)粒丟失的細胞成為優(yōu)勢群體;后者主要是指由于轉(zhuǎn)座和重組，使質(zhì)粒DNA重排或缺失。影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素有：①宿主細胞代謝負荷增加 質(zhì)粒載體可使宿主細胞的代謝負荷加重，有的能延長其世代時間15%左右。質(zhì)粒載體的大小同宿主細胞生長延緩的程度呈正相關(guān)，這可能是由于質(zhì)粒載體相對分子質(zhì)量大，則對宿主細胞DNA復制的負荷更大的緣故。同樣，宿主細胞如維持質(zhì)粒載體中外源基因的表達活性，勢必在DNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯上承受更多的額外負擔。②細胞中所含質(zhì)粒載體的拷貝數(shù) 細胞中所含質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)各不相同，也是影響質(zhì)粒丟失的一個因素�？截悢�(shù)差別不大時，質(zhì)粒載體相對地穩(wěn)定;拷貝數(shù)相差懸殊，則很容易造成一些細胞丟失質(zhì)粒，并逐漸發(fā)展為優(yōu)勢群體。③宿主細胞DNA重組系統(tǒng)的作用 質(zhì)粒載體之間發(fā)生重組會形成二聚體、三聚體，甚至四聚體等所謂的質(zhì)粒寡聚體(plasmid oligomer)，其穩(wěn)定性比單體差。此外，質(zhì)粒載體中外源DNA片段的大小同質(zhì)粒寡聚化的程度也密切相關(guān)。 |
2樓2014-02-18 13:24:38
3樓2014-02-18 14:17:20
yipan
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4樓2014-02-18 14:18:30
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