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xiaoyu0127銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
流式 已有1人參與
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本人想請教：我打算確認(rèn)購買的某PE標(biāo)記抗體的作用，所以打算做一個簡單的過程：收細(xì)胞-抗體孵育-上流式細(xì)胞儀，但是第一次，所以有一些問題還需要請教大家，希望見諒： 1.一般上流式會用到固定劑，請問我這種情況需要嗎； 2.實驗過程是不是：加刺激到一定時間--用PBS洗2次--棄上清--用100ul含2％BSA的PBS稀釋20ul PE流式抗體， 4C避光旋轉(zhuǎn)混勻過夜--預(yù)冷PBS洗3遍，用400 ulPBS重懸后，用流式檢測和數(shù)掘分析，每次計數(shù)5000個細(xì)胞。 希望大家不吝賜教，不足的地方也請多多包涵  另外，流式細(xì)胞的圖我目前只能看個大概，如果能分享一些專業(yè)的文件，不勝感激 [ Last edited by silicare on 2014-2-22 at 18:45 ] |
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2樓2014-02-21 22:28:05
【答案】應(yīng)助回帖
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xiaoyu0127: 金幣+3, ★★★很有幫助 2014-02-22 14:29:39
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xiaoyu0127: 金幣+3, ★★★很有幫助 2014-02-22 14:29:39
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1、看你的要求，不是都要固定的，不固定的圖形會好看。 但有的染色是必須固定的，所以還是要看你的要求，做的是什么，看高分文章中那些個牛的實驗室他們的條件是什么。 2、Buffer可以用PBE（PBS+FBS(BSA)+EDTA)，會好一點(diǎn)�？贵w染色看說明書，不是一定要染那么長時間的，長時間有時會出現(xiàn)假陽性。大多數(shù)抗體 4度半小時就好了。 至于計數(shù)看你的要求了，我們有次做白血病環(huán)境中造血干細(xì)胞的周期。如果算下來好像記的P2還是P3的數(shù)，這還計了不止10萬個細(xì)胞，那個圖也不好看，沒幾個細(xì)胞，還想多記些。那個保存的文件很大。。。 重懸體系不要太大，要不很費(fèi)時間100-200就好。當(dāng)然用來圈門的多一點(diǎn)好，要不損失細(xì)胞太多，不夠折騰的 抗體有錢就買BD的，差點(diǎn)買ebioscience的，再差買biolegend。 據(jù)說是一個人做的，做大了賣了。我們主要試過前兩個的效果差不多。 除了像PerCp-Cy5.5之類的很偏的染料，BD確實好，其他的像什么PE、FITC、PE-Cy7什么的差不多。沒必要費(fèi)銀子。 |
3樓2014-02-22 00:53:12
xiaoyu0127
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4樓2014-02-22 14:01:36
xiaoyu0127
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謝謝耐心解答，我理解了一下，這位蟲友的意思大致如下： 1.細(xì)胞最好多些，重懸體系小些（部分稀釋用來圈門） 2.我這個實驗是比較簡單的，細(xì)胞受刺激后，我的目的蛋白會在細(xì)胞表面表達(dá)，然后用PE標(biāo)記的抗體去染，當(dāng)場就測，這樣是不是不用固定？一般是不是涉及到保存細(xì)胞內(nèi)部的抗原狀態(tài)才需要？ 3.一般的流式細(xì)胞抗體稀釋劑：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3，不知道蟲友的EDTA的作用是什么？只是稀釋流式抗體加嗎，還是您做其他抗體實驗的抗體稀釋液配方 |
5樓2014-02-22 14:29:27
6樓2014-02-23 20:35:48
xiaoyu0127
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7樓2014-02-23 21:59:48
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