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[求助]
ELISA 不顯色 急急急
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哎。。。ELISA這么難嗎？以前的時(shí)候，是空白值太高（0.2左右），現(xiàn)在是所有的孔讀值都在0.09左右（空白孔也是），這是鬧哪樣，哪里都檢查了，不知道是哪一步錯(cuò)了？？？ 現(xiàn)在我把步驟寫下來(lái)了，希望高手解救一次吧�。�！ 采用間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)。 用pH 9.6, 0.15 mol.L-1的碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白稀釋為8、2、0.5μg·mL -1 , 包被酶標(biāo)板, 每孔100μL, 4℃包被過夜。次日每孔加入100μL 7%的山羊血清封閉液, 37℃封閉2h后, 用PBST洗滌3次。然后每孔加入400、800、1600、3200倍稀釋的羊抗血清100μL, 空白對(duì)照為兔抗血清稀釋液( BSA+PBS) , 37℃孵育1 h后, 同上洗滌3次。再次每孔加入100μL HRP標(biāo)記的羊抗人IgG, 37℃孵育30 min后, 同上洗滌3次。接下來(lái)每孔加入100μL TMB顯色液, 37℃避光反應(yīng)15 min后, 每孔再加入50μL 硫酸終止液。最后, 在酶標(biāo)儀上測(cè)450 nm下的OD值。 現(xiàn)在是用天根的TMB后，不顯色（幾乎沒有藍(lán)色），后來(lái)沒有辦法，用以前的ELISA試劑盒剩下的TMB，就顯色，TMB是新的，沒有問題，而且我用二抗加TMB后反應(yīng)藍(lán)色，這應(yīng)該是TMB和二抗都沒有問題吧？ 現(xiàn)在真不知道是哪里的原因了  |
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