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Engle_shen金蟲 (小有名氣)
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[求助]
請問是否可以直接對抗原進行染色呢？ 已有1人參與
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| 本人做材料出身，最近發(fā)現(xiàn)一種新材料，想做個最基本的免疫識別反應(yīng)，請問是否可以對抗原進行染色，然后與抗體進行識別，當(dāng)然大多數(shù)情況都是對抗體進行染色，識別抗原，不過俺想逆轉(zhuǎn)下，請高手指教，是否FITC可以像對抗體樣，對抗原進行染色，謝謝 |
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yipan 
銅蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
Engle_shen(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵交流 2014-02-27 09:04:05
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流式表面抗原染色方法 方案A：細胞懸液的表面抗原染色。 方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細胞核）。 小貼士： 1、流式抗體要儲存于避光4度，嚴格避免凍融。 2、流式抗體使用前要離心3min，避免貼壁蓋的損失，請勿斡旋混勻。 3、避免細胞成團，以免堵塞流式細胞儀。 4、eFluor納米晶體抗體參照該品說明進行改善。 方案A: 細胞懸液的表面抗原染色 實驗材料： 15×75mm圓底流式管或96孔板 直標(biāo)一抗或純化抗體 二抗（可選） 抗小鼠CD32/16抗體（eBioscience Cat. No. 14-0161） 人FCR結(jié)合抑制劑（eBioscience Cat. No. 14-9161） 流式染色液（eBioscience Cat. No. 00-4222）可自行配制 eFluor納米晶體抗體染色液（eBioscience Cat. No. 00-3222；可選） 7-AAD活度染色液（eBioscience Cat. No. 00-6993）或PI染色液（eBioscience Cat. No. 00-6990） 實驗流程： 1、按照樣品細胞制備方案制備懸浮細胞，調(diào)整濃度為2×107/ml。 2、（可選）封閉FCR介導(dǎo)的非特異性反應(yīng)： 小鼠：染色之前加0.5ug-1ug/100ul CD16/32抗體，孵育20min。 人類：染色之前加20ul 人FCR結(jié)合抑制劑孵育20min。 3、等分細胞懸液，每管50ul，再補加50ul染色液。 4、按照抗體說明書加入適量抗體，輕彈混勻。 5、直標(biāo)抗體。 方案B：淋巴組織細胞制備 實驗材料： 60×15mm 的組織培養(yǎng)皿 [5ml 注射器 細胞過濾器（尼龍網(wǎng)過濾） eBioscience® 流式染色緩沖液 (eBioscience Cat. No. 00-4222) 15ml或50ml的離心管。 注意： Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀釋為工作液（1:4稀釋）。 實驗方案： 1、按照流式樣品要求制備單細胞懸液。 2、按照流式表面染色方法標(biāo)記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。斡旋分散細胞。 3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品最長可以四度固定18小時）。 4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。 5、300g 室溫離心5min,棄上清。 6、2ml 1×permeabilization buffer重懸細胞。 7、300g 室溫離心5min,棄上清。 8、加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞內(nèi)抗原抗體），室溫避光孵育20min。 9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室溫離心5min,棄上清。 10、加2ml 流式染色液，300g 室溫離心5min,棄上清。 11、適量流式染色液重懸，即可上機檢測。同行對照依照上述步驟進行。軟件分析結(jié)果。 |
2樓2014-02-27 09:00:45
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