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shiyiyaya金蟲 (正式寫手)
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[求助]
克隆失敗原因：NdeI+KpnI？ 已有4人參與
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現(xiàn)有: 15K質(zhì)粒pA，NdeI+KpnI雙酶切之后產(chǎn)生11K+4K（回收11K做載體）； 6.7K質(zhì)粒pB，NdeI+KpnI雙酶切之后產(chǎn)生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）; 連接回收的11K和4K。 結(jié)果失敗：經(jīng)多種方案鑒定，轉(zhuǎn)化長出來的重組子都是質(zhì)粒pB. 我已經(jīng)嘗試單酶切*2次、PCR擴增4K片段，重新轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，挑單克隆再繼續(xù)…都不行。感覺就像pB沒有切干凈。 請問蟲友，可否遇到類似情況？NdeI+KpnI，這兩個酶的活性就是低嗎？ 謝謝幫忙！ |
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shiyiyaya
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堿裂解法小提質(zhì)粒，外源DNA切于2ug質(zhì)粒，載體片段切于800ng質(zhì)粒，酶切總體系30ul， 10U KpnI，F(xiàn)ermentas, FD Buffer; 10U NdeI, Thermo scientific, o buffer. 酶切2h，條帶清晰、干凈。凝膠回收柱回收（生工的）。 載體片段溶于30ul TE，外源片段溶于15ul ddH2O. 連接使用NEB T4DLig，10ul體系，載體取1ul，外源全部用上，buffer、水補齊。 16度過夜、轉(zhuǎn)化、鑒定。 一般來說，12個轉(zhuǎn)化子，10個一樣，都是外源的原始質(zhì)粒，7K左右大小。其余的也不正確。 求解��！ |
5樓2014-03-05 23:02:38
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| 酶切的話，不存在那種酶的酶活性問題，有的只是不同廠家的酶質(zhì)量問題，另外存放等影響因素。當(dāng)然操作時添加適當(dāng)?shù)牧恳彩窍喈?dāng)重要的。我覺得你說說你的酶切和連接具體操作會有助于大家對你進行分析。 |
2樓2014-03-05 20:19:38
lvbobo823
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3樓2014-03-05 20:54:57
shiyiyaya
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4樓2014-03-05 22:53:08
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