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shiyiyaya金蟲 (正式寫手)
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[求助]
克隆失敗原因：NdeI+KpnI？ 已有4人參與
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現(xiàn)有: 15K質(zhì)粒pA，NdeI+KpnI雙酶切之后產(chǎn)生11K+4K（回收11K做載體）； 6.7K質(zhì)粒pB，NdeI+KpnI雙酶切之后產(chǎn)生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）; 連接回收的11K和4K。 結(jié)果失�。航�(jīng)多種方案鑒定，轉(zhuǎn)化長(zhǎng)出來(lái)的重組子都是質(zhì)粒pB. 我已經(jīng)嘗試單酶切*2次、PCR擴(kuò)增4K片段，重新轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，挑單克隆再繼續(xù)…都不行。感覺就像pB沒有切干凈。 請(qǐng)問(wèn)蟲友，可否遇到類似情況？NdeI+KpnI，這兩個(gè)酶的活性就是低嗎？ 謝謝幫忙！ |
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atlanticwi
金蟲 (正式寫手)
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-06 12:38:32
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............. 首先，酶自身不會(huì)有問(wèn)題，其次，我不明白的是這個(gè)問(wèn)題，你PCR 4K片段，再做連接，會(huì)不會(huì)長(zhǎng)出來(lái)的也是pB質(zhì)粒？如果是，污染是可能性很大，我估計(jì)那個(gè)7k左右的質(zhì)粒其實(shí)并不是pB。我以前遇到這種情況，雙酶切載體（載體上帶片段，所以雙酶切可以分辨清楚），用了一個(gè)不加片段而加ddH2O的對(duì)照，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)出來(lái)的很多克隆，這些克隆用一個(gè)酶酶切是原來(lái)載體的樣子，用另一個(gè)酶酶切就不對(duì)了。所以我懷疑污染的可能性要大于載體自連的可能性。 所以針對(duì)你的情況，我的建議是這樣，把4K的片段克隆到T載體上，然后用T載體上酶切下來(lái)的片段和11K做連接。繞過(guò)對(duì)pB質(zhì)粒進(jìn)行的直接操作。另一個(gè)，做構(gòu)建盡量選用硅膠柱做質(zhì)粒提取是比較合適的。 |
8樓2014-03-06 06:21:13
鬼羽帝魂
木蟲 (著名寫手)
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12樓2014-03-06 10:25:35
【答案】應(yīng)助回帖
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shiyiyaya: 金幣+2, ★有幫助 2014-03-06 20:28:28
| 酶切的話，不存在那種酶的酶活性問(wèn)題，有的只是不同廠家的酶質(zhì)量問(wèn)題，另外存放等影響因素。當(dāng)然操作時(shí)添加適當(dāng)?shù)牧恳彩窍喈?dāng)重要的。我覺得你說(shuō)說(shuō)你的酶切和連接具體操作會(huì)有助于大家對(duì)你進(jìn)行分析。 |
2樓2014-03-05 20:19:38
lvbobo823
鐵桿木蟲 (正式寫手)
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3樓2014-03-05 20:54:57
shiyiyaya
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4樓2014-03-05 22:53:08
shiyiyaya
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堿裂解法小提質(zhì)粒，外源DNA切于2ug質(zhì)粒，載體片段切于800ng質(zhì)粒，酶切總體系30ul， 10U KpnI，F(xiàn)ermentas, FD Buffer; 10U NdeI, Thermo scientific, o buffer. 酶切2h，條帶清晰、干凈。凝膠回收柱回收（生工的）。 載體片段溶于30ul TE，外源片段溶于15ul ddH2O. 連接使用NEB T4DLig，10ul體系，載體取1ul，外源全部用上，buffer、水補(bǔ)齊。 16度過(guò)夜、轉(zhuǎn)化、鑒定。 一般來(lái)說(shuō)，12個(gè)轉(zhuǎn)化子，10個(gè)一樣，都是外源的原始質(zhì)粒，7K左右大小。其余的也不正確。 求解啊！ |
5樓2014-03-05 23:02:38
【答案】應(yīng)助回帖
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既然你都切開了，那就是連接酶的問(wèn)題。不知道你這個(gè)質(zhì)粒的抗性如何。 此外，沒圖沒真相啊。建議你跑一個(gè)pB沒有酶切的，pB單酶切，pB雙酶切的對(duì)比一下 既然出現(xiàn)兩條帶，不太可能是沒切干凈，感覺。 還有內(nèi)切酶不行的話換個(gè)牌子的內(nèi)切酶試一下。但是個(gè)人覺得你用的那個(gè)牌子的內(nèi)切酶還是很強(qiáng)悍的。我構(gòu)建過(guò)3個(gè)載體，都是用Fe***的。 有一點(diǎn)我很好奇，為啥你內(nèi)切酶用Fe****的，連接酶用N**的。 質(zhì)粒有沒有切干凈我個(gè)人感覺看電泳圖就能說(shuō)明問(wèn)題。我質(zhì)粒單酶切都是單一條帶，沒有切過(guò)的質(zhì)粒都是2-3條帶。 另外你說(shuō)都是重組子pB，這個(gè)結(jié)論你是怎么得出來(lái)的？？測(cè)序驗(yàn)證？PCR檢驗(yàn)？ 質(zhì)粒、RNA跑電泳的話marker純粹僅僅作為參照，并不能絕對(duì)反映出質(zhì)�；蚴荝NA的真實(shí)大小��！ |
6樓2014-03-05 23:51:51
7樓2014-03-06 00:02:47
shiyiyaya
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9樓2014-03-06 08:17:29
shiyiyaya
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10樓2014-03-06 08:21:04
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